鉭顆粒影響成骨細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

康成容 李梁 李張維 周折沖 周倩冰 潘宣

廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科（廣州510080）

早期愈合、早期負(fù)重以及長期良好的生物相容性是對(duì)骨、關(guān)節(jié)植入物的基本要求。鈦及鈦合金材料作為傳統(tǒng)的骨、關(guān)節(jié)植入物，具有生物相容性好、強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)，但其生物活性欠佳，細(xì)胞長入植體表面并獲得初期穩(wěn)定性的時(shí)間較長，且其彈性模量與骨組織相差較大，容易造成應(yīng)力集中，影響植體的長期穩(wěn)定性。

鉭金屬具有熔點(diǎn)高、強(qiáng)度大、耐腐蝕等理化性質(zhì)和良好的生物相容性，有“親生物”金屬之稱，植入體內(nèi)后，生物組織易在其表面生長［1］。通過氣相沉積和滲透方法，將微米或納米級(jí)的鉭粉涂覆于種植體表面［2-3］，形成性能更優(yōu)的鉭涂層種植體。與普通鈦種植體相比，鉭涂層種植體具有更優(yōu)異的骨整合能力，在體外表現(xiàn)為成骨細(xì)胞粘附增強(qiáng)，細(xì)胞增殖和分化增加，細(xì)胞凋亡減少，在體內(nèi)表現(xiàn)為骨愈合效率增強(qiáng)［4］。在長期的循環(huán)負(fù)載過程中，應(yīng)力勞損可使鉭涂層種植體表面的鉭顆粒脫落。這種脫落的磨損顆粒與種植體周圍組織和細(xì)胞直接接觸，引起一系列應(yīng)激反應(yīng)，可能影響骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡。那么，鉭涂層種植體表面脫落的鉭顆粒對(duì)成骨細(xì)胞增殖有什么影響？其機(jī)制如何？

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑微米鉭、納米鉭、Rapamy-cin、3-MA（Sigma-Aldrich，美國），MC3T3-E1細(xì)胞系（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫），alpha-MEM培養(yǎng)基（α-MEM，Invitrogen，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鉭顆粒準(zhǔn)備用透射電鏡和掃描電鏡對(duì)鉭顆粒的表面形貌進(jìn)行表征。動(dòng)態(tài)光散射法（dynamic light scattering，DLS）分析顆粒在溶劑中的團(tuán)聚現(xiàn)象。鉭顆粒經(jīng)伽馬射線鈷-60（25Ggy）消毒后經(jīng)超聲乳化制成10 mg/mL微米鉭和1 mg/mL納米鉭母液。

1.2.2 MC3T3-E1培養(yǎng)將MC3T3-E1接種于含10%FBS、1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)。2～3 d換1次液，80%生長滿度時(shí)消化傳代。

1.2.3 CCK8實(shí)驗(yàn)（1）實(shí)驗(yàn)分組：為檢測(cè)不同濃度鉭顆粒對(duì)細(xì)胞增殖的影響，微米鉭和納米鉭均設(shè)9個(gè)濃度梯度，分別是1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、1 mg/mL。檢測(cè)共培養(yǎng) 6、12、24、48 h時(shí)細(xì)胞的OD值。為驗(yàn)證自噬在細(xì)胞增殖中的作用，分別用自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin 200 nmol/L或自噬抑制劑3-MA 10 mmol/L預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后加入0或20 μg/mL納米鉭，共培養(yǎng)24 h，測(cè)OD值。（2）測(cè)OD值：以1×103/孔的密度將MC3T3-E1接種于96孔板，孵育24 h待細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理。在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)按CCK8說明書檢測(cè)OD450nm值。利用公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGR）：RGR=［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%，其中As為實(shí)驗(yàn)孔OD值，Ac為對(duì)照孔OD值，Ab為空白孔OD值。

1.2.4 Western blot分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組（200 nmol/L Rapamycin預(yù)處理1 h）、實(shí)驗(yàn)組（與100 ng/mL微米鉭或20 μg/mL納米鉭共培養(yǎng)）。取對(duì)數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細(xì)胞，以1×106/皿的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿。24 h細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理，共培養(yǎng)24 h，檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3B和p62表達(dá)。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)分組及處理同Western blot。將細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于6孔板，24 h干預(yù)結(jié)束后加入含LC3B抗體（1∶200稀釋）的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h；然后加入含70 nmol/L LysoTracker?Red DND-99的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h；再加入含Hoechst 33342（5 μg/mL）的PBS緩沖液處理20 min；最后用抗熒光猝滅劑封片，鏡下觀察LC3B標(biāo)記的綠色熒光表達(dá)情況。

1.2.6 透射電鏡實(shí)驗(yàn)分組及處理同Western blot。將細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于6孔板，24 h干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞，固定、脫水、包埋、切片、染色，鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間采用單因素方差分析（One Way ANOVA）檢驗(yàn)方差齊性。方差齊則進(jìn)一步進(jìn)行樣本均數(shù)兩兩比較的LSD檢驗(yàn)；方差不齊則采用Dunnett′s T3檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鉭顆粒表征圖1為鉭顆粒的電鏡和DLS表征結(jié)果。微米鉭形狀不規(guī)則，呈多面體或近球形，直徑從100 nm到5 μm不等；納米鉭為形狀較規(guī)則的圓球形，粒徑約8～15 nm。微米鉭的平均水合粒徑為1281 nm，納米鉭的平均水合粒徑為292 nm。

2.2 鉭顆粒與細(xì)胞增殖圖2為微米鉭和納米鉭處理后細(xì)胞相對(duì)增殖率的柱形圖。結(jié)果表明：就濃度因素而言，鉭顆粒在低濃度時(shí)促增殖作用不明顯，隨著濃度加大，促增殖作用逐漸顯現(xiàn)，100 ng/mL微米鉭和20 μg/mL納米鉭最明顯，之后與濃度負(fù)相關(guān)；就時(shí)間因素而言，鉭顆粒在共培養(yǎng)初期時(shí)均抑制細(xì)胞生長，隨著時(shí)間延長，其促增殖作用逐漸顯現(xiàn)，雖然48 h時(shí)鉭顆粒的促增殖作用也很明顯，但此時(shí)細(xì)胞太密，狀態(tài)欠佳，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均共培養(yǎng)24 h。

2.3 細(xì)胞自噬的檢測(cè)根據(jù)CCK8結(jié)果，篩選出促增殖作用最明顯的100 ng/mL微米鉭和20 μg/mL納米鉭，共培養(yǎng)24 h。

2.3.1 Western blot如圖3所示，與陰性對(duì)照組相比，微米鉭組的LC3-II和p62條帶沒有明顯變化；納米鉭組的LC3-II和p62條帶分別增強(qiáng)和減弱。灰度值分析也符合這個(gè)趨勢(shì)：相較陰性對(duì)照組，微米鉭組的LC3-II/LC3-I和p62/actin比值無明顯差異（P＞0.05）；納米鉭組的LC3-II/LC3-I比值明顯升高（P＜0.01），p62/actin比值下降（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，微米鉭組未檢測(cè)到明顯的細(xì)胞自噬，20 μg/mL納米鉭在促成骨細(xì)胞增殖的同時(shí)誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬。

2.3.2 激光共聚焦顯微鏡納米鉭組可見明顯的點(diǎn)狀聚集的綠色熒光，微米鉭組未見到明顯的綠色熒光，表明納米鉭誘導(dǎo)了明顯的細(xì)胞自噬（圖4）。

2.3.3 透射電鏡納米鉭組可見大量的自噬泡結(jié)構(gòu)以及被細(xì)胞內(nèi)吞的納米鉭顆粒；微米鉭組無明顯的自噬泡，可見膨脹的線粒體及變形的細(xì)胞器（圖5）。說明納米鉭誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬，而微米鉭沒有。

圖1 鉭顆粒表征Fig.1 Characterization of tantalum particles

圖2 微米鉭和納米鉭處理后MC3T3-E1的相對(duì)增殖率Fig.2 RGR of MC3T3-E1 treated by micro-Ta and nano-Ta

2.4 自噬與細(xì)胞增殖由圖6可見，自噬誘導(dǎo)劑或抑制劑單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響；20 μg/mL納米鉭組，自噬誘導(dǎo)劑可促進(jìn)細(xì)胞增殖，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），自噬抑制劑則顯著抑制細(xì)胞增殖（P＜0.001）。說明20 μg/mL納米鉭促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖可能主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)揮作用，一旦自噬被抑制，其促增殖作用則被抵消，這為試圖通過調(diào)節(jié)自噬水平而調(diào)控納米鉭的促增殖作用提供了依據(jù)。

3 討論

成骨細(xì)胞是骨改建過程中最重要的功能細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的形成和鈣化，在骨形成與礦化過程中發(fā)揮重要作用。作為最早接觸磨損顆粒的細(xì)胞之一，成骨細(xì)胞對(duì)骨組織的代謝平衡起著重要作用。MC3T3-E1具有較高的細(xì)胞增殖能力，廣泛用于各類有關(guān)成骨的研究中［5-6］。α-MEM培養(yǎng)基的精氨酸含量（592 μm）較DMEM培養(yǎng)基（367 μm）高，而MC3T3-E1生長需要消耗較多的精氨酸［7］，因此MC3T3-E1在α-MEM培養(yǎng)基中增殖較快。

圖3 Western blot檢測(cè)自噬蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of autophagy protein by Western Blot

圖4 激光共聚焦顯微鏡圖像Fig.4 Laser confocal microscope image

圖5 透射電鏡超微結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Ultrastructure of transmission electron microscope

圖6 納米鉭和自噬調(diào)節(jié)劑處理后MC3T3-E1的相對(duì)增殖率Fig.6 RGR of MC3T3-E1 treated by nano-Ta and autophagy regulator

傳統(tǒng)的鈦種植體存在骨愈合時(shí)間偏長、早期穩(wěn)定性欠佳等問題。鑒于鉭金屬優(yōu)異的生物學(xué)性能及其在骨科的廣泛應(yīng)用，鉭涂層種植體正逐漸應(yīng)用于口腔種植領(lǐng)域。SCHLEE等［8］對(duì)早期負(fù)重的鉭涂層種植體進(jìn)行為期1年的隨訪，發(fā)現(xiàn)其成功率為100%。另一個(gè)為期1年的多中心隨機(jī)臨床研究發(fā)現(xiàn)鉭涂層種植體的成功率為95.2%［9］，這些數(shù)據(jù)為鉭涂層種植體的早期負(fù)重提供了理論支持。在長期的咬合負(fù)載下，種植體表面的涂層鉭顆粒可能脫落，與種植體周圍組織和細(xì)胞直接接觸并引起一系列應(yīng)激反應(yīng)，可能影響種植體的長期效果。ZHU等［10］將鉭薄膜涂覆的鈦片浸于PBS溶液28 d，檢測(cè)到＜2 μg/mL鉭的釋放。BONUTTI等［11］報(bào)道，在一個(gè)使用多孔鉭人工膝蓋的全膝關(guān)節(jié)成形術(shù)后發(fā)生了鉭金屬顆粒的釋放。因此，有必要深入研究鉭顆粒對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

目前有關(guān)鉭片［12］、多孔鉭［13-14］以及鉭薄膜［10］、鉭涂層［1，4］等的研究較多，而關(guān)于鉭顆粒與細(xì)胞直接作用的研究卻很少。臨床上，長期的應(yīng)力負(fù)載使鉭涂層種植體表面的鉭顆粒發(fā)生少量脫落，這些脫落的鉭顆粒分散于種植體周圍，與成骨細(xì)胞廣泛接觸。本文從研究細(xì)胞增殖入手，將成骨細(xì)胞與鉭顆粒共培養(yǎng)以模擬植體周圍磨損顆粒的微環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微米鉭和納米鉭分別在100 ng/mL和20 μg/mL時(shí)促增殖作用最明顯；共培養(yǎng)初期對(duì)細(xì)胞增殖均有一定抑制作用，可能是培養(yǎng)初期細(xì)胞對(duì)“異物”鉭顆粒的“排斥”反應(yīng)，隨著時(shí)間延長，鉭顆粒的促增殖作用逐漸顯現(xiàn)出來，細(xì)胞在低于閾值濃度鉭顆粒的作用下，經(jīng)歷了“適應(yīng)-共存”的過程，受損后又恢復(fù)，保持繼續(xù)增殖［15］。由此可見，少量脫落的鉭顆粒可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，這為保證鉭涂層種植體的長期有效性提供了理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)納米鉭的促增殖作用較微米鉭更明顯，促增殖的最佳濃度也不同，可能與各自的促增殖機(jī)制有關(guān)。HUO等［16］研究發(fā)現(xiàn)納米晶相表面的鉭比傳統(tǒng)粗晶相表面的鉭具有更高的表面親水性和更強(qiáng)的耐腐蝕性。納米物質(zhì)有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的能力，而自噬是細(xì)胞降解受損細(xì)胞器和外來有害物質(zhì)并轉(zhuǎn)化為生長所需氨基酸、能量等物質(zhì)的過程，可發(fā)揮促細(xì)胞生存作用［17-18］。細(xì)胞識(shí)別外來物質(zhì)為異物，并將其吞噬、降解，引發(fā)包括自噬在內(nèi)的一系列應(yīng)激反應(yīng)，以試圖清除外來物質(zhì)［19］。外來物質(zhì)主要通過3種途徑進(jìn)入細(xì)胞：（1）小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用：發(fā)生于膜富含膽固醇的區(qū)域（大約60～80 nm），與細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)有關(guān)；（2）網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用：指受小窩蛋白等膜蛋白調(diào)控的膜內(nèi)陷（～200 nm），與病原、營養(yǎng)和感受器的內(nèi)在化有關(guān)；（3）巨胞飲/吞噬：指攝入營養(yǎng)物質(zhì)和抗原等大的內(nèi)陷（＞0.2 μm），是細(xì)菌和病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要機(jī)制［20］。納米顆粒的直徑＜100 nm，可通過小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，之后被轉(zhuǎn)移至溶酶體、內(nèi)涵體、自噬體等結(jié)構(gòu)［20］，引發(fā)細(xì)胞自噬等應(yīng)激反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)納米鉭顆粒促增殖的同時(shí)誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬發(fā)生。基于以上研究現(xiàn)狀，筆者推測(cè)：納米鉭可能通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞自噬而發(fā)揮促增殖作用。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，筆者運(yùn)用自噬誘導(dǎo)劑或抑制劑干擾納米鉭誘導(dǎo)的自噬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬誘導(dǎo)劑或抑制劑本身對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響，這與 YANG［5，18］等學(xué)者的研究結(jié)果一致。自噬抑制劑則顯著抑制20μg/mL納米鉭誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，提示納米鉭可能主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)揮促增殖作用，一旦自噬被抑制，其促增殖作用則被抵消。mTOR是調(diào)節(jié)自噬信號(hào)途徑的關(guān)鍵信號(hào)分子，研究發(fā)現(xiàn)蒲黃總黃酮可通過抑制Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞的自噬活動(dòng)［21-23］，納米鉭誘導(dǎo)成骨細(xì)胞自噬的分子機(jī)制和信號(hào)通路將是筆者下一步研究的內(nèi)容。微米鉭由于粒徑較大，成骨細(xì)胞難以將其內(nèi)吞，其促增殖的機(jī)制可能經(jīng)由其他非自噬途徑，這也將是我們今后探索的方向。

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