E2蛋白介導(dǎo)豬瘟病毒的細(xì)胞吸附與內(nèi)化

尹彩霞，于少雄，宋琨，李素，楊玉瑩，仇華吉

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E2蛋白介導(dǎo)豬瘟病毒的細(xì)胞吸附與內(nèi)化

尹彩霞1，2，于少雄2，宋琨2，李素2，楊玉瑩1，仇華吉2

（1長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069）

【目的】已有研究顯示，豬瘟病毒（CSFV）通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用侵入宿主細(xì)胞，然而參與侵入過程的病毒蛋白尚待闡明。研究旨在明確E2蛋白在CSFV侵入過程中的作用。【方法】通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染包裝攜帶E2基因的慢病毒，將慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)懸浮293細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)重組E2蛋白的懸浮293細(xì)胞系，利用親和層析的方法純化重組E2蛋白，同時(shí)優(yōu)化表達(dá)時(shí)間以增加蛋白產(chǎn)量。利用SDS-PAGE和Western blotting分別鑒定了重組E2蛋白的表達(dá)水平及其反應(yīng)原性。通過感染試驗(yàn)、吸附試驗(yàn)以及內(nèi)化試驗(yàn)分別探究了E2蛋白對CSFV感染、吸附以及內(nèi)化的影響。將重組E2蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，通過阻斷ELISA檢測血清中多克隆抗體的阻斷率。利用制備的多克隆抗體與CSFV感作后進(jìn)行吸附和內(nèi)化試驗(yàn)，進(jìn)一步探究了E2蛋白在介導(dǎo)CSFV吸附和內(nèi)化中的作用。【結(jié)果】通過倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒后的細(xì)胞系，與對照細(xì)胞相比可見明顯的綠色熒光，表明慢病毒成功轉(zhuǎn)導(dǎo)懸浮293細(xì)胞。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在還原和非還原條件下均出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的蛋白條帶，經(jīng)Western blotting驗(yàn)證，上清中表達(dá)的重組E2蛋白能夠被抗E2蛋白單克隆抗體WH303所識別，表明構(gòu)建的懸浮293細(xì)胞系能夠表達(dá)重組E2蛋白。通過優(yōu)化表達(dá)條件，懸浮293細(xì)胞培養(yǎng)第8天時(shí)上清中重組E2蛋白濃度最高可達(dá)5.84 μg·mL-1。可溶性蛋白阻斷試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組E2蛋白具有阻斷CSFV感染的活性。利用重組E2蛋白在病毒入侵過程中處理細(xì)胞對CSFV的感染同樣具有顯著抑制作用；阻斷ELISA和中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，針對E2蛋白的多克隆抗體能夠阻斷CSFV感染，且具有良好的中和活性；吸附試驗(yàn)和內(nèi)化試驗(yàn)證明，重組E2蛋白處理細(xì)胞能夠顯著抑制CSFV的內(nèi)化，而利用多克隆抗體與CSFV感作后能夠顯著抑制其吸附。【結(jié)論】E2蛋白參與CSFV吸附和內(nèi)化。

豬瘟病毒；E2蛋白；懸浮細(xì)胞系；吸附；內(nèi)化

0 引言

【研究意義】豬瘟（classical swine fever，CSF）是一種由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的高致病性、高死亡率的急性傳染病，對很多國家養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，病毒粒子有囊膜，基因組是一條長約12.3 kb的單股正鏈RNA[3-4]。CSFV的復(fù)制周期包括吸附、內(nèi)化、膜融合、早期蛋白質(zhì)的合成、基因組復(fù)制以及病毒粒子的裝配和釋放等，其中病毒的侵入作為其復(fù)制周期的初始環(huán)節(jié)，對病毒的繁殖發(fā)揮決定性作用。瘟病毒屬成員大都利用受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用侵入宿主細(xì)胞[5-7]，最近報(bào)道，CSFV利用受體介導(dǎo)的網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用侵入宿主細(xì)胞，該進(jìn)程在低pH環(huán)境下進(jìn)行，依賴動(dòng)力蛋白和膽固醇，同時(shí)需要Rab5和Rab7的參與[8]。在侵入過程中，CSFV利用自身囊膜蛋白與細(xì)胞膜表面受體分子發(fā)生相互作用，目前，在吸附受體方面的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但內(nèi)化受體仍有待鑒定。總之，對侵入機(jī)制的研究不僅能夠明確病毒的感染和發(fā)病機(jī)理，更為抗病毒治療提供新型的藥物靶標(biāo)，因此，研究CSFV的侵入機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。【前人研究進(jìn)展】Erns、E1和E2是位于CSFV表面的3種囊膜蛋白[9]，Erns通過與吸附受體作用介導(dǎo)CSFV的吸附，已知的CSFV吸附受體包括硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）[10]和層粘連蛋白受體（laminin receptor，LamR）[11]，CD46分子被鑒定為CSFV的吸附因子[12]。E2蛋白位于病毒粒子表面，與E1蛋白形成異源二聚體，是CSFV重要的抗原蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[13]。在偽型病毒侵入試驗(yàn)中，證明E1和E2蛋白足以介導(dǎo)CSFV侵入易感細(xì)胞[14]。CSFV的侵入包含吸附和內(nèi)化過程，在吸附過程中，通過吸附受體與囊膜蛋白結(jié)合使病毒粒子富集在宿主表面，隨之病毒粒子與宿主細(xì)胞的空間距離和細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境發(fā)生變化，使病毒囊膜蛋白發(fā)生變構(gòu)，進(jìn)一步與內(nèi)化受體結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒的內(nèi)化[15]。【本研究切入點(diǎn)】目前，明確參與CSFV侵入的囊膜蛋白包括Erns、E1和E2，但具體哪種蛋白、如何介導(dǎo)CSFV的吸附和內(nèi)化仍然未知。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過探究重組E2蛋白對CSFV吸附和內(nèi)化的影響，明確E2蛋白是否參與CSFV吸附和內(nèi)化，為發(fā)現(xiàn)CSFV細(xì)胞受體提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

研究在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。PK-15細(xì)胞和CSFV石門株由本團(tuán)隊(duì)保存，懸浮293細(xì)胞購自上海源培生物科技股份有限公司，針對CSFV E2蛋白的單克隆抗體WH303[16]由英國動(dòng)植物衛(wèi)生機(jī)構(gòu)（APHA）Trevor Drew教授提供，pMD19-T simple載體購自寶生物工程有限公司，pLVX-IRES-ZsGreen1載體購自Clontech公司，psPAX2和pMD2.G慢病毒包裝輔助質(zhì)粒購自Addgene。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

為了構(gòu)建重組E2蛋白的表達(dá)載體，根據(jù)CSFV E2基因全長序列設(shè)計(jì)引物，在E2基因5￠端引入R I酶切位點(diǎn)，3￠端去除編碼跨膜區(qū)的基因片段，引入Flag和Strep雙標(biāo)簽（兩個(gè)標(biāo)簽之間以TEV酶切位點(diǎn)連接）以及I酶切位點(diǎn)，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列如下（斜體字分別為R I和I酶切位點(diǎn)，下劃線處分別為Strep標(biāo)簽、TEV酶切位點(diǎn)和Flag標(biāo)簽）：SME2-F：5'-CGGCCACCATGG TATTAAGAGGGCAGATCGTGC-3'；SME2-R(FTS)：5'-CCCTATTCTGCGAAGTAATCTGAGTGG-3'。

1.3 重組E2蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以CSFV石門株cDNA為模板，利用Ex-Taq酶擴(kuò)增E2基因片段。回收PCR產(chǎn)物，連接至pMD19-T simple載體。測序正確后，以該重組質(zhì)粒為模板，利用PrimeSTAR高保真酶擴(kuò)增包含F(xiàn)lag和Strep雙標(biāo)簽的E2基因片段，將其插入pLVX-IRES-ZsGreen1載體中，得到重組質(zhì)粒pLVX-SM-E2-FTS。

1.4 包含E2基因的慢病毒的包裝

將HEK-293T細(xì)胞鋪入六孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先，把細(xì)胞培養(yǎng)液換成含10% FBS的DMEM，同時(shí)將重組質(zhì)粒pLVX-SM-E2-FTS、輔助質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G與X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑（羅氏公司）配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，靜置20 min后加到細(xì)胞上清中，培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞上清，5 000×離心去除細(xì)胞碎片，分裝后貯存于-80℃冰箱中，得到慢病毒Lenti-SM-E2-FTS。

1.5 表達(dá)E2蛋白的懸浮293細(xì)胞系的構(gòu)建

將懸浮293細(xì)胞培養(yǎng)傳代至細(xì)胞穩(wěn)定生長之后，按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）為1用重組慢病毒Lenti-SM-E2-FTS進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，得到懸浮細(xì)胞系293-SM-E2。37℃培養(yǎng)48 h后，換成新鮮的培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。

1.6 重組E2蛋白的純化

將細(xì)胞懸液倒入50 mL離心管，500×離心5 min后，收取上清到新管，用10 kD超濾管（Merck Millipore公司）將含有重組蛋白的上清液從100 mL濃縮至10 mL。將高親和力Strep標(biāo)簽樹脂（GE公司）填入層析柱中，用預(yù)冷的PBS洗5次，之后加入濃縮的蛋白，于4℃條件下翻轉(zhuǎn)結(jié)合過夜，棄去穿流液后，用PBS洗5次以除去未結(jié)合的蛋白，用脫硫生物素（Sigma公司）于4℃條件下洗脫。

1.7 SDS-PAGE電泳及Western blotting

將純化的蛋白加入5×loading buffer后煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素薄膜上，經(jīng)5%脫脂乳封閉1 h后，用抗E2蛋白單克隆抗體WH303于室溫孵育2 h，用PBS洗5次，加入IRDye800CW山羊抗小鼠IgG抗體（LI-COR Bioscience公司）避光孵育1 h，再用PBS洗5次，利用近紅外熒光成像系統(tǒng)（Odyssey）掃描并讀取結(jié)果。

1.8 抗E2蛋白多克隆抗體的制備及檢測

將20 μg純化的重組E2蛋白與QuickAntibody- Mouse3W免疫佐劑（北京博奧龍公司）混合后，通過肌肉注射免疫BALB/c小鼠，一免后2 w以相同的劑量進(jìn)行二次免疫，二免后1 w采血并分離血清，利用豬瘟抗體檢測試劑盒（IDEXX公司）檢測E2蛋白特異性抗體水平，最后摘除眼球采血，分離血清，得到抗E2蛋白多克隆抗體（抗E2多抗），保存于-20℃?zhèn)溆谩＠弥泻驮囼?yàn)檢測抗E2多抗的中和滴度，具體操作步驟參照歐盟豬瘟診斷手冊有關(guān)抗體檢測部分。

1.9 細(xì)胞總RNA的提取及熒光定量RT-PCR

RNA的提取步驟參照Life Technologies公司的TRIzol試劑說明書進(jìn)行，利用反轉(zhuǎn)錄酶（寶生物工程有限公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過熒光定量RT-PCR（RT-qPCR）檢測CSFV基因組拷貝數(shù)，操作參照ZHAO等的報(bào)道進(jìn)行[17]。

接著，查理也送給盛旦老師一個(gè)碩大的信封。盛旦老師打開信封，大聲念出上面用金色筆寫的字：一張牌可以快樂享受退休的日子。

1.10 蛋白阻斷試驗(yàn)

重組E2蛋白對CSFV感染的影響：將不同濃度重組E2蛋白（0、10、20和40 μg·mL-1）與MOI為0.1的CSFV混合后加入到PK-15細(xì)胞中，37℃感染48 h后檢測病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度。

重組E2蛋白對CSFV侵入的影響：將不同濃度重組E2蛋白（0、10、20和40 μg·mL-1）與MOI為0.1的CSFV混合后加入到PK-15細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)2 h，棄掉上清后換成含2% FBS的DMEM，37℃感染48 h后檢測病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度。

重組E2蛋白對CSFV吸附的影響：將不同濃度重組E2蛋白（0、10、20和40μg·mL-1）與MOI為1的CSFV混合后加入到PK-15細(xì)胞中，4℃吸附PK-15細(xì)胞2 h，棄去上清后用PBS洗細(xì)胞3次，以去掉未吸附的病毒粒子，加入含2% FBS的DMEM，37℃感染48 h后檢測病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度。

1.11 吸附和內(nèi)化試驗(yàn)

將PK-15細(xì)胞鋪入24孔板，待細(xì)胞生長48 h后進(jìn)行吸附和內(nèi)化試驗(yàn)。在吸附試驗(yàn)中，將陰性血清和不同稀釋度的抗E2多抗（1﹕50、1﹕100、1﹕200、1﹕400和1﹕800）與MOI為1的CSFV在4℃感作2 h，同時(shí)將PK-15細(xì)胞在4℃條件下預(yù)冷15 min，再將處理后的病毒加到PK-15細(xì)胞中，4℃吸附2 h，棄掉上清后，用PBS洗細(xì)胞3次去掉未吸附的病毒粒子，用TRIzol試劑裂解細(xì)胞提取總RNA，RT-qPCR檢測病毒基因組拷貝數(shù)。

在內(nèi)化試驗(yàn)中，將不同濃度重組E2蛋白（0、10、20和40 μg·mL-1）與MOI為1的CSFV混合后加入到PK-15細(xì)胞中，4℃吸附2 h，然后轉(zhuǎn)至37℃培養(yǎng)2 h以完成內(nèi)化，或?qū)OI為1的CSFV接種于PK-15細(xì)胞，在4℃吸附2 h，用PBS洗細(xì)胞3次以去掉未吸附的病毒粒子，再加入陰性血清或不同稀釋度的抗E2多抗（1﹕50、1﹕100、1﹕200、1﹕400和1﹕800）在4℃感作1 h，然后轉(zhuǎn)至37℃培養(yǎng)2 h以完成內(nèi)化，將以上的細(xì)胞用PBS洗3次后，依次用0.05%的胰酶處理2 min、stripping buffer處理1 min、0.5 mg·mL-1的蛋白酶K處理2 min，以除去吸附到細(xì)胞表面但未內(nèi)化的病毒粒子[18-19]，用TRIzol試劑裂解細(xì)胞提取總RNA，RT-qPCR檢測病毒基因組拷貝數(shù)。

1.12 抗體封閉試驗(yàn)

將PK-15細(xì)胞鋪24孔板，待細(xì)胞匯和度達(dá)到80%后進(jìn)行試驗(yàn)，將陰性血清和不同稀釋度的抗E2多抗（1﹕50、1﹕100、1﹕200、1﹕400和1﹕800）與MOI為0.1的CSFV在37℃感作2 h，再加入PK-15細(xì)胞中，感染48 h后，收取上清測定病毒滴度，利用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染量[20]。

2 結(jié)果

2.1 重組CSFV E2蛋白的表達(dá)與鑒定

2.1.1 表達(dá)重組E2蛋白的懸浮293細(xì)胞系建立 通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法建立懸浮293細(xì)胞系，倒置熒光顯微鏡下可見明顯的綠色熒光（圖1-a），表明慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)成功。利用Strep標(biāo)簽樹脂通過親和層析的方法純化目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting檢測（圖1-b、c），與對照組相比，在還原和非還原條件下分別在55—70 kD之間以及130 kD處各呈現(xiàn)一條特異性條帶，為E2蛋白單體和二聚體形式，表明構(gòu)建的懸浮細(xì)胞系可穩(wěn)定表達(dá)重組E2蛋白。

2.1.2 重組E2蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 慢病毒載體攜帶ZsGreen1熒光標(biāo)記，因此，采用流式細(xì)胞分選系統(tǒng)進(jìn)行陽性細(xì)胞的分選以增加蛋白表達(dá)量（結(jié)果未顯示）。為了優(yōu)化重組蛋白表達(dá)，將懸浮293細(xì)胞系傳至125 mL的細(xì)胞瓶，在相同的培養(yǎng)條件下，分別在第2、4、6、8、10和12天收集培養(yǎng)上清，經(jīng)Strep標(biāo)簽樹脂純化后測定蛋白濃度，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)至第8 天時(shí)重組蛋白表達(dá)量最高，上清中的濃度約為5.84 μg·mL-1（圖1-d）。

a：檢測慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的293懸浮細(xì)胞的熒光水平；b：SDS-PAGE鑒定重組E2蛋白；c：Western blotting鑒定重組E2蛋白；d：重組E2蛋白表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化。M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1和3：293細(xì)胞上清中純化的蛋白；2和4：293-SM-E2細(xì)胞上清中純化的蛋白

2.2 重組E2蛋白抑制CSFV感染

為了驗(yàn)證重組E2蛋白對CSFV感染的影響，用重組E2蛋白預(yù)處理細(xì)胞30 min，接種CSFV后培養(yǎng)2 h，換成含2% FBS的DMEM，48 h后檢測病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度，結(jié)果顯示，重組E2蛋白預(yù)處理細(xì)胞對CSFV感染沒有影響（結(jié)果未顯示）。已有研究顯示，CSFV E2蛋白與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合力不強(qiáng)[21]，因此，將不同濃度的重組E2蛋白和CSFV混合后加入到PK-15細(xì)胞中，48 h后檢測重組E2蛋白對CSFV感染的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，病毒基因組復(fù)制水平和病毒滴度均顯著下降（圖2-a、b）。以上結(jié)果表明，制備的重組E2蛋白具有阻斷CSFV感染的活性。

a：RT-qPCR檢測CSFV基因組拷貝數(shù)；b：病毒滴定檢測CSFV病毒滴度。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；ns，不顯著，P > 0.05。下同

2.3 E2蛋白參與CSFV的吸附

CSFV侵入過程包含吸附和內(nèi)化階段，利用囊膜蛋白與吸附受體互作后，進(jìn)一步通過內(nèi)化受體將病毒內(nèi)吞到宿主細(xì)胞內(nèi)，然后起始病毒基因組的翻譯、轉(zhuǎn)錄及復(fù)制等功能。先利用蛋白封閉試驗(yàn)驗(yàn)證E2蛋白對CSFV侵入的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，病毒基因組復(fù)制水平和病毒滴度均顯著下降（圖3-a、b），表明E2蛋白參與CSFV的侵入。進(jìn)一步驗(yàn)證E2蛋白對CSFV吸附的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，病毒基因組復(fù)制水平和病毒滴度均無顯著差異（圖3-c、d）。這表明，重組E2蛋白不能阻斷CSFV對細(xì)胞的吸附。

為了進(jìn)一步明確E2蛋白對CSFV吸附的影響，免疫BALB/c小鼠制備抗E2多抗，經(jīng)阻斷ELISA試劑盒檢測，血清均發(fā)生陽轉(zhuǎn)（結(jié)果未顯示）；中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，抗E2多抗的中和滴度可達(dá)1 600—5 120（圖4-a）。為了驗(yàn)證抗E2多抗對CSFV的封閉效果，利用不同稀釋度的抗E2多抗進(jìn)行抗體封閉試驗(yàn)，結(jié)果顯示，與陰性血清相比，抗E2多抗對CSFV的感染具有顯著的抑制作用，50倍稀釋時(shí)可使病毒滴度降低約1 000倍（圖4-b、c）。接下來按照該抗體和CSFV的使用濃度進(jìn)行吸附試驗(yàn)，用不同稀釋度的抗E2多抗處理CSFV后進(jìn)行吸附試驗(yàn)，結(jié)果顯示，封閉CSFV表面的E2蛋白后顯著地降低了CSFV對PK-15細(xì)胞的吸附水平（圖4-d）。以上結(jié)果表明，E2蛋白參與CSFV的吸附。

2.4 E2蛋白介導(dǎo)CSFV的內(nèi)化

為了探究E2蛋白對CSFV內(nèi)化的作用，首先，利用重組E2蛋白進(jìn)行內(nèi)化試驗(yàn)，結(jié)果顯示，重組E2蛋白能夠顯著抑制CSFV的內(nèi)化水平，處理濃度為2.5 μg·mL-1時(shí)抑制效率可達(dá)50%左右，且隨著蛋白濃度的增加，其抑制水平顯著增強(qiáng)（圖5-a）。氯丙嗪（chlorpromazine，CPZ）是一種通過抑制網(wǎng)格蛋白形成從而抑制病毒內(nèi)化的藥物抑制劑[22]，利用該試劑作為對照，結(jié)果顯示，其對CSFV內(nèi)化有明顯的抑制作用（圖5-b）。隨后，為了佐證E2蛋白參與CSFV的內(nèi)化，利用抗E2多抗進(jìn)行內(nèi)化試驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對照組相比，CSFV的內(nèi)化水平無顯著差異（圖5-c），表明抗E2多抗不能通過封閉吸附到宿主細(xì)胞上的CSFV而抑制CSFV的內(nèi)化。

a、b：在侵入過程中加入重組E2蛋白對CSFV感染的影響；c、d：在吸附過程中加入重組E2蛋白對CSFV感染的影響

a：用中和試驗(yàn)檢測抗E2多抗的中和效價(jià)；b、c：抗E2多抗處理CSFV后對其感染的影響；d：抗E2多抗處理CSFV對其吸附的影響

a：重組E2蛋白對CSFV內(nèi)化的影響；b：氯丙嗪處理細(xì)胞對CSFV內(nèi)化的影響；c：抗E2多抗處理CSFV對其內(nèi)化的影響

3 討論

E2蛋白是CSFV的主要保護(hù)性抗原之一，不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，而且能激活機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答[23-24]。該蛋白是CSFV重要的毒力決定因子，與病毒的致弱機(jī)制相關(guān)[25]。通過表達(dá)CSFV囊膜蛋白的偽型病毒研究病毒感染的機(jī)制，證明E2蛋白是參與CSFV侵入的關(guān)鍵蛋白，但與其互作的細(xì)胞受體仍然未知[14]。近些年，相繼有研究人員嘗試了CSFV受體篩選相關(guān)的研究，但始終沒有突破性進(jìn)展，分析可能受病毒粒子與宿主特定的作用關(guān)系的限制，因此，解析參與CSFV侵入的關(guān)鍵囊膜蛋白和宿主的作用機(jī)制，可以推進(jìn)這一進(jìn)程的發(fā)展。

黃病毒科代表成員丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的侵入是由病毒粒子表面多個(gè)囊膜蛋白與宿主蛋白協(xié)同互作，從而引發(fā)的一系列反應(yīng)[26-27]。CSFV是否也與同科病毒具有類似的侵入機(jī)制？由Erns蛋白與宿主相互作用起始侵入環(huán)節(jié)，之后引發(fā)其他囊膜蛋白與一個(gè)甚至多個(gè)宿主分子作用后完成整個(gè)侵入進(jìn)程？在這其中還需要哪些宿主分子的參與？這都是未來亟待解決的問題。在本研究中，筆者初步探索了E2蛋白在CSFV吸附和內(nèi)化中的作用，而沒有涉及參與CSFV侵入的其他蛋白分子，包括Erns蛋白是否參與CSFV內(nèi)化的研究，或者E1和E2蛋白之間是否通過二聚體形式與宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用，從而引發(fā)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等。

本研究通過慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建了以分泌形式表達(dá)重組E2蛋白的懸浮293細(xì)胞系，同時(shí)制備了針對重組E2蛋白的多抗，抗體封閉試驗(yàn)證明，E2蛋白參與CSFV吸附（圖4-d），利用重組E2蛋白進(jìn)行內(nèi)化試驗(yàn)證明，E2蛋白參與CSFV的內(nèi)化（圖5-a），有趣的是，當(dāng)CSFV吸附到細(xì)胞表面之后再加入抗體進(jìn)行內(nèi)化試驗(yàn)，則對CSFV內(nèi)化無顯著影響（圖5-c）。據(jù)此推測，介導(dǎo)CSFV吸附的細(xì)胞受體也能將其內(nèi)吞進(jìn)細(xì)胞內(nèi)。另外，用重組E2蛋白預(yù)處理PK-15細(xì)胞后，無法阻斷CSFV的感染，然而，在細(xì)胞培養(yǎng)上清中添加重組E2蛋白卻顯著抑制CSFV的感染。由此推測，重組E2蛋白與宿主細(xì)胞的結(jié)合力較弱，但是能夠通過關(guān)鍵位點(diǎn)的“位阻效應(yīng)”阻斷CSFV的感染。這表明，全長E2蛋白并不適合CSFV受體的篩選。盡管如此，能夠結(jié)合宿主細(xì)胞且阻斷病毒感染的肽段具有一定的應(yīng)用價(jià)值[28-29]。

4 結(jié)論

4.1 通過慢病毒系統(tǒng)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)重組E2蛋白的懸浮293細(xì)胞系；

4.2 通過蛋白阻斷和抗體封閉試驗(yàn)證明，E2蛋白參與CSFV的吸附和內(nèi)化。

[1] JI W, GUO Z, DING NZ, HE C Q. Studying classical swine fever virus: making the best of a bad virus., 2015, 197:35-47.

[2] LUO Y, LI S, SUN Y, QIU H J. Classical swine fever in China: a minireview., 2014, 172(1-2):1-6.

[3] WANG F I, DENG M C, HUANG Y L, CHANG C Y. Structures and functions of pestivirus glycoproteins: not simply surface matters., 2015, 7(7):3506-3529.

[4] MEYERS G, RüMENAPF T, THIEL H J. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus.y, 1989, 171(2):555-567.

[5] BOYD B L, LEE TM, KRUGER E F, PINCHUK L M. Cytopathic and non-cytopathic bovine viral diarrhoea virus biotypes affect fluid phase uptake and mannose receptor-mediated endocytosis in bovine monocytes., 2004, 102:53-65.

[6] FLORES E F, KREUTZ L C, DONIS R O. Swine and ruminant pestiviruses require the same cellular factor to enter bovine cells., 1996, 77(Part6):1295-1303.

[7] GRUMMER B, GROTHA S, GREISER-WILKE I. Bovine viral diarrhoea virus is internalized by clathrin-dependent receptor- mediated endocytosis., 2004, 51: 427-432.

[8] SHI B J, LIU C C, ZHOU J, WANG S Q, GAO Z, ZHANG X M, ZHOU B, CHEN P Y. Entry of classical swine fever virus into PK-15 cells via a pH-, dynamin-, and cholesterol-dependent, clathrin- mediated endocytic pathway that requires Rab5 and Rab7., 2016, 90(20):9194-9208.

[9] MOORMANN R J, WARMERDAM P A, VAN DER MEER B, SCHAAPER W M, WENSVOORT G, HULST M M. Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera virus strain Brescia and mapping of the genomic region encoding envelope protein E1., 1990, 177(1):184-198.

[10] HULST M M, VAN GENNIP H G P, MOORMANN R J M. Passage of classical swine fever virus in cultured swine kidney cells selects virus variants that bind to heparan sulfate due to a single amino acid change in envelope protein Erns., 2000, 74(20): 9553-9561.

[11] CHEN J, HE W R, SHEN L, DONG H, YU J, WANG X, YU S, LI Y, LI S, LUO Y, SUN Y, QIU H J. The laminin receptor is a cellular attachment receptor for classical swine fever virus., 2015, 89(9):4894-4906.

[12] DR?GER C, BEER M, BLOME S. Porcine complement regulatory protein CD46 and heparan sulfates are the major factors for classical swine fever virus attachment., 2015, 160(3):739-746.

[13] WEILAND F, WEILAND E, UNGER G, SAALMüLLER A, THIEL H J. Localization of pestiviral envelope proteins Ernsand E2 at the cell surface and on isolated particles.,1999, 80(5):1157-1165.

[14] WANG Z, NIE Y, WANG P, DING M, DENG H. Characterization of classical swine fever virus entry by using pseudotyped viruses: E1 and E2 are sufficient to mediate viral entry., 2004, 330(1): 332-341.

[15] EL OMARI K, IOURIN O, HARLOS K, GRIMES J M, STUART D I. Structure of a pestivirus envelope glycoprotein E2 clarifies its role in cell entry., 2013, 3(1):30-35.

[16] EDWARDS S, SANDS J J. Antigenic comparisons of hog cholera virus isolates from Europe, America and Asia using monoclonal antibodies., 1990, 97(2):79-81.

[17] ZHAO J J, CHENG D, LI N, SUN Y, SHI Z, ZHU Q H, TU C, TONG G Z, QIU H J. Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR for quantitative and differential detection of wild-type viruses and C-strain vaccine of classical swine fever virus., 2008, 126(1-3):1-10.

[18] WANG H B, ZHANG H, ZHANG J P, LI Y, ZHAO B, FENG G K, DU Y, XIONG D, ZHONG Q, LIU W L, DU H, LI M Z, HUANG W L, TSAO S W, HUTT-FLETCHER L, ZENG Y X, KIEFF E, ZENG M S. Neuropilin 1 is an entry factor that promotes EBV infection of nasopharyngeal epithelial cells., 2015, 6:6240.

[19] HOLLA P, AHMAD I, AHMED Z, JAMEEL S. Hepatitis E virus enters liver cells through a dynamin-2, clathrin and membrane cholesterol-dependent pathway., 2015, 16:398-416.

[20] REED L J, MUENCH H. A simple method of estimating fifty percent endpoints., 1938, 27:493-497.

[21] HULST M M, MOORMANN R J. Inhibition of pestivirus infection in cell culture by envelope proteins Ernsand E2 of classical swine fever virus: Ernsand E2 interact with different receptors.,1997, 78(11):2779-2787.

[22] HUANG H C, CHEN C C, CHANG W C, TAO M H, HUANG C. Entry of hepatitis B virus into immortalized human primary hepatocytes by clathrin-dependent endocytosis., 2012, 86(17):9443-9453.

[23] CEPPI M, DE BRUIN M G, SEUBERLICH T, BALMELLI C, PASCOLO S, RUGGLI N, WIENHOLD D, TRATSCHIN J D, MCCULLOUGH K C, SUMMERFIELD A. Identification of classical swine fever virus protein E2 as a target for cytotoxic T cells by using mRNA-transfected antigen-presenting cells., 2005, 86(9):2525-2534.

[24] GANGES L, BARRERA M, Nú?EZ J I, BLANCO I, FRIAS M T, RODRíGUEZ F, SOBRINO F. A DNA vaccine expressing the E2 protein of classical swine fever virus elicits T cell responses that can prime for rapid antibody production and confer total protection upon viral challenge., 2005, 23(28):3741-3752.

[25] RISATTI G R, BORCA M V, KUTISH G F, LU Z, HOLINKA L G, FRENCH R A, TULMAN E R, ROCK D L. The E2 glycoprotein of classical swine fever virus is a virulence determinant in swine., 2005a, 79(6):3787-3796.

[26] DOUAM F, LAVILLETTE D, COSSET F L. The mechanism of HCV entry into host cells., 2015, 129:63-107.

[27] RISATTI G R, BORCA M V, KUTISH G F, LU Z, HOLINKA L G, FRENCH R A, TULMAN E R, ROCK D L. The E2 glycoprotein of classical swine fever virus is a virulence determinant in swine., 2005, 79(6):3787-3796.

[28] LI X, WANG L, ZHAO D, ZHANG G, LUO J, DENG R, YANG Y. Identification of host cell binding peptide from an overlapping peptide library for inhibition of classical swine fever virus infection., 2011, 43(1):33-40.

[29] MEI Y, YUE F, NING H M, ZHOU J J, WANG X N. Identification of the linear ligand epitope on classical swine fever virus that interacts with porcine kidney 15 cells., 2017, 81(3):186-191.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

The E2 Protein Mediates the Attachment and Internalization of Classical Swine Fever Virus in Cells

YIN Caixia1, 2, YU Shaoxiong2, SONG Kun2, LI Su2, YANG Yuying1, QIU HuaJi2

(1Collegeof Animal Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei;2State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology / Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069)

【Objective】It has been shown that the entry of classical swine fever virus (CSFV) into host cells is mediated by clathrin-mediated endocytosis. However, the viral protein involved in entry stage remains to be elucidated. This study aimed to clarify the role of the E2 protein in the entry of CSFV. 【Method】Lentivirus carrying the E2 gene were packaged by transient transfection of HEK-293T cells. A cell line stably expressing the E2 protein was established through transducing the suspension 293 cell with the lentiviruses. The expression of the recombinant E2 (rE2) protein was optimized to achieve higher production, and the rE2 protein was purified by affinity chromatography. The expression level and reactivity of the rE2 protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting. The effects of the E2 protein on CSFV infection, attachment and internalization were determined by respective assays. Polyclonal anti-E2 antibodies were prepared by immunizing BALB/c mice with the rE2 protein, and its blocking rate was determined by blocking ELISA. Attachment and internalization assays were performed using the prepared polyclonal antibodies to demonstrate the role of the E2 protein in virus attachment and internalization. 【Result】The cell line 293 was successfully transduced with the lentivirus vector. The SDS-PAGE produced the anticipated band size of rE2 no matter the sample was treated with the reducing agent or not. Western blotting results showed that the rE2 protein could be recognized by the anti-E2 monoclonal antibody WH303. The results indicated that suspension 293 cell line could stably express the rE2 protein. Under the optimized expression condition, the concentration of the rE2 protein in the supernatants of the established suspension 293 cell line was up to 5.84 μg·mL-1. Soluble protein blocking assay results showed that the expressed rE2 protein exerted antiviral activity during the process of CSFV infection. CSFV infection were significantly inhibited by the rE2 protein treated in the entry step; Blocking ELISA and serum neutralization test showed that the anti-E2 polyclonal antibodies could neutralize CSFV infection; at the same time, attachment and internalization assays demonstrated that CSFV internalization could be inhibited by the rE2 protein and viral attachment was blocked by the polyclonal antibodies. 【Conclusion】The E2 protein was involved in attachment and internalization of CSFV.

classic swine fever virus; E2 protein; suspension cell line; attachment; internalization

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.018

2017-12-13；

2018-04-16

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（31630080）

尹彩霞，E-mail：yincaixia92@163.com。通信作者仇華吉，E-mail：huajiqiu@hvri.ac.cn