短小芽孢桿菌AR03揮發性有機物的抑菌活性及其組分分析

王靜，曹建敏，陳德鑫，邱軍，王曉強，馮超，王文靜

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短小芽孢桿菌AR03揮發性有機物的抑菌活性及其組分分析

王靜，曹建敏，陳德鑫，邱軍，王曉強，馮超，王文靜

（中國農業科學院煙草研究所，山東青島 266101）

【目的】對分離自煙草根際土壤中的一株短小芽孢桿菌（）AR03菌株產生的揮發性有機物進行抑菌活性測定和組分分析。【方法】采用培養皿對扣熏蒸法和凹玻片孢子萌發法測定揮發性有機物對煙草黑脛病菌（var.）和赤星病菌（）菌落、菌絲生長以及孢子萌發的影響，采用離體葉片接種法測定揮發性有機物對煙草黑脛病和赤星病的防治效果；采用頂空加熱法收集抑菌揮發性有機物，對其進行氣相色譜-質譜（GC-MS)檢測，并結合保留指數（retention index，RI）和內標（internal standard，IS）1-十五烯對其組分進行定性和定量分析。【結果】短小芽孢桿菌AR03菌株分泌的揮發性有機物對供試的兩種病原真菌均具有一定的抑制作用，表現為經處理后的煙草黑脛病菌菌絲生長稀疏緩慢變粗、分支增多且扭曲、斷裂；赤星病菌菌絲生長畸形，其上不產生分生孢子梗，內含物大部分聚集成團導致菌絲干癟、縊縮。對峙培養2、4、6和8 d時，揮發物對黑脛病菌和赤星病菌菌絲生長的抑制率分別為56.21%和59.23%、64.75%和59.86%、66.13%和61.10%、67.04%和70.00%；對黑脛病菌游動孢子和赤星病菌分生孢子的抑制作用表現為延遲萌發且萌發后的芽管生長緩慢；黑脛病菌產生孢子囊數明顯減少，赤星病菌分生孢子各分隔處的細胞畸形腫脹成泡狀。離體葉片抗病測定結果顯示，揮發性有機物抑制黑脛病菌和赤星病菌病斑在葉片的擴展,對峙熏蒸40 h時，對照葉片黑脛病的發病率為92.50%，圓形壞死病斑直徑是25.10 mm，經揮發物處理后葉片發病率為70.83%，病斑直徑為9.45 mm，對黑脛病斑擴散的抑制率為62.35%；對峙熏蒸80 h時，對照葉片赤星病的發病率為88.33%，病斑擴散為近圓形的褐色壞死斑，平均直徑為8.32 mm，經揮發物處理后赤星病的發病率為60.80%，病斑擴展較慢，平均直徑為2.85 mm，揮發物對赤星病斑擴散的抑制率為65.75%。SPME GC-MS分析表明，AR03菌株胞外分泌7種組分揮發性物質，均為C15H24結構的倍半萜烯類化合物，分別是二氫姜黃烯、()--金合歡烯、-姜黃烯、-姜烯、-紅沒藥烯、-倍半萜水芹烯和--紅沒藥烯；AR03培養1 d后，其中-倍半萜水芹烯相對含量最高，為80.64%，其次為()--金合歡烯和-姜烯，相對含量分別為7.20%和6.67%；隨著AR03培養時間的延長，各組分種類相同，但相對含量差異較大，除二氫姜黃烯含量保持基本不變外，其他組分含量呈遞減趨勢，培養至第6天時，各組分含量下降超過50%。【結論】短小芽孢桿菌AR03菌株能夠產生具有較強抑菌活性的揮發性有機物，有潛力作為開發抗真菌代謝物和新藥物的重要微生物資源。

短小芽孢桿菌AR03; 揮發性有機物；煙草黑脛病菌；煙草赤星病菌；頂空-固相微萃取-氣質聯用

0 引言

【研究意義】煙草黑脛病（病原菌var.）和赤星病（病原菌）是威脅世界煙草生產的兩個重要病害。黑脛病常導致植株萎蔫壞死、根部變黑腐爛，最終整株死亡，每年對世界煙草生產造成百億美元的損失[1]。目前，黑脛病的防治措施主要包括健康栽培、抗性品種利用、合理輪作及殺菌劑甲霜靈（metalaxyl）的施用。然而，長期大量施用甲霜靈會帶來環境問題并產生抗甲霜靈菌株的風險[2]。赤星病是煙草成熟期葉部重要的病害之一，氣候適宜往往暴發流行，造成嚴重經濟損失。使用化學殺菌劑是赤星病防治的主要措施，但可能會導致烤后煙葉農殘超標。因此，尋找能持續防控此病害和其他作物同類病害的新途徑具有重要意義。【前人研究進展】利用有益微生物（生物農藥）作為合理而安全的作物管理措施是較有前景的方法[3]。基于拮抗微生物和病原物互作的生物防治被認為是減少化學農藥使用和改善植物健康的可替代或補充的方式[4-5]。研究表明，生物防治因子（biological control agents，BCAs）如芽孢桿菌（）、假單胞菌（）、放線菌（）、木霉菌（）和酵母菌（yeast）在抑制病原細菌和真菌方面均具有良好的表現[6-10]。生物防治因子的作用機制主要包括抗生作用，定殖位點、營養或礦物質的競爭，寄生和噬菌體[11]；其中通過分泌抗真菌代謝物質（antifungal metabolites，AFMs）來發揮對病原真菌的抗生作用是最常見的策略，目前研究較多的抗真菌代謝物質主要有抗生素、酶和揮發物[12]。作為抗真菌代謝物質之一的混合著各種以碳為基礎的氣相混合物的揮發性有機物（volatile organic compounds，VOCs），由于其小分子，體積小，易擴散到大氣和土壤中，是理想的信息素，并且已被應用于昆蟲、致病和污染有害菌的生物防治。作為生物防治因子的芽孢桿菌屬細菌種類繁多，能夠產生大量廣譜且具有抗生活性的次生代謝產物，其中環狀的脂肽類物質具有抗真菌和細菌等生物學功能[13]，在這些抗生物質中，揮發性物質大都是由一組低分子量親脂類物質組成的混合物，來源于很多微生物的不同生物合成途徑，其中的一些揮發性代謝產物可采用氣體處理的方式用于生物熏蒸[14]。圍繞芽孢桿菌屬細菌產生揮發物的抗生活性已展開了廣泛的研究，20世紀90年代，Fiddaman等[15]報道了枯草芽孢桿菌（）分泌抗真菌揮發性物質過程中培養基質的重要性。近來又相繼報道了解淀粉芽孢桿菌（）在果實病害防治中的應用，解淀粉芽孢桿菌CPA-8產生的揮發物質抑制甜櫻桃采后果實腐爛真菌核果褐腐菌（）、美澳型核果褐腐菌（）和灰葡萄孢（）菌絲的生長，能減輕櫻桃采后腐爛程度。通過SPME-GC分析，CPA-8產生的主要揮發物為1,3-戊二烯、3-羥基丁酮和噻吩，各純品的體外菌絲生長抑制試驗和對3種腐爛病菌的EC50測定結果顯示，噻吩是揮發物中最有效的成分[16]。在防治植物細菌病害方面，解淀粉芽孢桿菌T-5菌株產生的揮發物能夠明顯地抑制引起番茄青枯病的青枯雷爾氏菌（），且對該病菌的運動性、根部定殖、生物膜形成及其胞外多糖的產生具有抑制作用[17]。【本研究切入點】分離自貴州煙區黑脛病田塊健康煙株根際土壤的短小芽孢桿菌（）AR03菌株，對煙草黑脛病菌、赤星病菌、青枯病菌、白粉病菌和炭疽病菌均有較好的拮抗活性，兼具促生作用[18-21]。進一步的研究表明，AR03發酵液（3×108cfu/ml）對上述病原菌具有拮抗活性，但其除菌上清液卻無活性。筆者對該拮抗菌株分泌的活性物質進行分析，發現該菌株能夠產生揮發性物質且具有拮抗活性。【擬解決的關鍵問題】分析短小芽孢桿菌AR03菌株產生的揮發性物質對煙草黑脛病菌、赤星病菌的抑菌活性及其組成成分，為該菌株在病害生物防治上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2016年9月至2017年9月在中國農業科學院煙草研究所完成。

1.1 供試菌株、培養基、培養條件與試劑

短小芽孢桿菌AR03（CGMCC No. 4117）分離和鑒定參見文獻[18]。常規活化采用NA培養基（酵母提取物5.0 g，蛋白胨5.0 g，氯化鈉1.5 g，瓊脂13.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.3，121℃滅菌20 min），28℃恒溫、黑暗條件培養36 h。將AR03接種于NB培養基（配方同NA，不加瓊脂）中，120 r/min、28℃振蕩培養48 h后獲得AR03發酵液，經低溫冷凍離心后的菌體經適量ddH2O梯度稀釋后，采用分光光度計調整菌體懸浮液濃度為108cfu/mL，備用。

煙草黑脛病菌和煙草赤星病菌為筆者實驗室在田間病株采集、分離、鑒定并保存。活化黑脛病菌和赤星病菌培養基分別為燕麥培養基（OA）和馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA），28℃培養5 d后備用。皮氏培養液：硝酸鈣0.4 g，磷酸二氫鉀0.15 g，硝酸鎂0.15 g，氯化鈣0.06 g，蒸餾水1 L，121℃ 15 min滅菌，備用。土壤浸出液：稱取煙草品種紅花大金元根際土壤25 g，溶于50 g蒸餾水中，攪拌均勻后室溫靜置30 min，經濾紙過濾后的溶液121℃ 15 min滅菌，備用。手動萃取手柄，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，20 mL棕色頂空瓶，購自美國Supelco公司；1-十五烯、正構烷烴（C7-C30）購自北京百靈威公司；二氯甲烷、甲醇均為色譜純；美國安捷倫7890B-5975C氣相色譜質譜儀。

1.2 揮發性有機物對煙草黑脛病菌和赤星病菌體外抑制作用測定

1.2.1 對菌絲生長和形態的影響 接種環粘取活化的AR03菌落后均勻、密集地于NA平板上劃線，使該細菌布滿平板；另取煙草黑脛病菌和赤星病菌菌碟（Φ=5 mm）分別接種于OA和PDA平板的中央，參照王靜等[21]方法在距菌碟1.5 cm處30°傾斜插入滅菌的蓋玻片，然后與布滿AR03菌體的NA平板對扣，周圍用封口膜密封，28℃、黑暗條件下恒溫培養，另以空白NA平板為對照，間隔2 d分別觀察并測量處理和對照平板菌落直徑，一直到對照平板菌絲長滿，共調查4次，每處理3次重復。生長抑制率計算公式參照周翠等[22]，比較揮發物的拮抗效果。試驗重復2次。抑制率計算公式：

抑制率（%）=（單獨培養菌落直徑-菌落趨向直徑）/單獨培養菌落直徑×100

分別將培養6 d的煙草黑脛病菌和赤星病菌培養皿內附著菌絲的蓋玻片置于倒置顯微鏡下（目鏡10倍）觀察經揮發物處理后菌絲的形態變化。

1.2.2 對孢子萌發的影響 首先制備煙草黑脛病菌游動孢子懸浮液和赤星病菌分生孢子懸浮液。分別將預先活化的黑脛病菌和赤星病菌菌碟（Φ=5 mm）接種于OA和PDA平板中央28℃培養14 d后，誘導黑脛病菌產生孢子囊和游動孢子懸浮液制備方法如下：在盛有15 mL皮氏培養液無菌培養皿內接入8個黑脛病菌菌碟（Φ=6 mm），然后加入100 μL土壤浸出液，置于28℃恒溫箱中黑暗培養3 d后，將培養皿置于4℃擱置2 h，再轉到28℃條件培養18 h，在無菌條件下，將培養皿內的菌餅移入盛有適量無菌水的離心管中，輕微振蕩后經4層無菌紗布過濾收集游動孢子，載玻片法在光學顯微鏡下觀察，隨后通過梯度稀釋和血小球計數板計數法將游動孢子懸浮液調整為2×104個/mL備用。赤星病菌孢子懸浮液制備方法如下：倒入適量的無菌水于長滿菌絲的平板內，用涂布器涂布平板表面，使得菌絲和孢子懸浮于無菌水中，將此混合液經4層無菌紗布過濾后并收集，按照上述方法在倒置顯微鏡下觀察并調整孢子懸浮液濃度為2×104個/mL，備用。

各取100 μl黑脛病菌游動孢子懸浮液和赤星病菌孢子懸浮液置于滅菌的凹玻片上，同時置于保濕的培養皿內，上面倒扣均勻劃滿AR03菌體的NA平板，對照為NA培養基，封口膜密封后置于28℃恒溫分別黑暗培養6 h后，在倒置顯微鏡下觀察形態變化。每個視野觀察10個孢子，共觀察5個視野，芽管的長度是孢子的兩倍視為孢子萌發。計算各處理抑制游動孢子和分生孢子萌發和生長的抑制率，每處理3次重復。試驗重復2次。孢子萌發抑制率計算公式：

孢子萌發抑制率（%）=（對照組孢子萌發數-處理組孢子萌發數）/對照組孢子萌發數×100

1.2.3 揮發性有機物離體葉片的抑菌測定 揮發物抑制煙草黑脛病和赤星病的離體葉片生測接種采用菌餅接種和孢子懸浮液懸滴接種，具體如下：于NA平板（直徑15 cm）密集劃線接種AR03菌株，對照為空白的NA平板；另外培養皿底部分別放置2片大小適宜的煙草葉片紅花大金元（用于黑脛病生測試驗）和品種NC89（成熟期，用于赤星病抗病試驗），浸濕的棉球包圍葉柄保濕，葉片表面無菌水噴霧后，在主脈兩側各選取適宜數量的接種點，針刺制造傷口后，分別接種黑脛病菌碟（Φ=6 mm）和懸滴100 μL赤星病菌孢子懸浮液（濃度為1×107個孢子/mL），每處理10個皿，3次重復。將接種細菌的培養皿與接種葉片的培養皿對扣后Parafilm封口膜密封，30℃黑暗條件下對峙培養40 h和80 h后調查病斑在葉片上擴展情況并計算抑制率。抑制率計算公式：

病斑擴展抑制率（%）=（對照組病斑直徑-處理組病斑直徑）/對照組病斑直徑×100

1.3 揮發性有機物的收集及其組分分析

1.3.1 1-十五烯內標溶液配制 稱取20 mg 1-十五烯對照品，純度不低于98.5%，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得到濃度為2 mg·mL-11-十五烯內標母液，然后取適量1-十五烯內標母液用甲醇稀釋400倍，得到濃度為5 μg·mL-11-十五烯內標溶液，備用。

1.3.2 AR03細菌揮發物收集-頂空-固相微萃取法 移液器吸取3 mL尚未冷卻的NA培養基（約55℃），傾倒于20 mL滅菌的棕色頂空瓶中，并將瓶體傾斜15°角，待培養基冷卻凝固后，取100 μL預先制備好的AR03菌懸液均勻涂布于培養基斜面上，迅速用含有聚四氟內涂層的瓶蓋封口，將頂空瓶置于28℃恒溫箱中靜置、黑暗培養，為了排除培養基釋放的揮發物和萃取頭涂層流失對細菌揮發物鑒定結果的干擾，設置不涂布AR03菌懸液處理為空白對照，每個樣品3個重復。

將培養2 d的頂空瓶置于室溫中平衡20 min后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（購于Supelco公司）進行采樣，萃取頭使用前，需先按照廠家提供的說明書進行老化。采樣前首先用5 μL尖頭微量注射器向頂空瓶側壁注入2 μL濃度為5 μg·mL-11-十五烯內標溶液，注意盡量避免接觸培養基基質，平衡30 min后，將SPME針管刺入頂空瓶，同時將萃取頭推出，置于頂空瓶上部1/3處，采集細菌分泌的揮發性有機物，采樣時間為30 min。采集完畢后，將萃取頭收起，并將針管拔出樣品瓶，樣品收集結束。

1.3.3 利用氣象色譜-質譜聯用（GC-MS）技術分析揮發性物質組分 GC-MS分析條件：色譜柱DB-5MS彈性毛細管色譜柱，規格為30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口250℃：不分流模式；初始溫度40℃，以100℃·min-1速率升至250℃，解吸時間5 min；載氣為99.999%氦氣，流速為1.0 mL·min-1；柱溫箱：初始溫度40℃，保持2 min，以5℃·min-1速率升至180℃，保持10 min，以10℃·min-1速率升至280℃，保持15 min，總運行時間為55 min；EI離子源，電子能量70 ev；離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃；全掃描模式，掃描范圍30—400 m/z。數據采集處理系統，安捷倫MassHunter（B.05.02）軟件。

1.3.4 抑菌揮發性有機物成分鑒定 揮發物MS結果經NIST和WILIY譜庫自動檢索，要求匹配率＞80，初步進行識別。對于識別的每種代謝物，根據其相鄰正構烷烴的保留時間和碳原子數，計算其保留指數，然后查閱文獻報道的該物質在相同色譜柱中的保留指數（retention index，RI），進一步進行確證。保留指數計算公式：

RI=100z+100[TR(x)-TR(z)]/[TR(z+1)-TR(z)]（線性程序升溫）

式中，TR(x)、TR(z)、TR(z+1)分別代表組分x及碳數為z、z+1正構烷的保留溫度。且TR(z)＜TR(x)＜TR(z+1)，由于保留溫度和保留時間通常具有高度的相關性，所以用保留時間代替上式中的保留溫度來進行計算保留指數。

1.3.5 不同生長期抑菌揮發性有機物組分定量分析 按照1.3.2方法分別將培養1、3、6 d的AR03，按照1.3.2、1.3.3和1.3.4方法收集細菌揮發物進行GC-MS檢測，并進行定量分析。抑菌揮發性有機物半定量分析以添加到頂空瓶中的1-十五烯作為內標（internal standard，IS），假設內標與生防菌株AR03揮發物的相對校正因子為1，按下述公式計算目標代謝物的相對含量。

mi= m15×（Ai/A15）

式中，mi為目標代謝物含量（μg）；m15為加入1-十五烯的量（μg）；Ai為目標代謝物總離子流圖峰面積；A15為1-十五烯總離子流圖峰面積。

2 結果

2.1 揮發性有機物對供試病原菌菌絲生長的影響

平板對扣法測定結果顯示，揮發性有機物對煙草黑脛病菌和赤星病菌菌絲生長的抑制作用較強，對赤星病菌的抑制表現為菌落生長緩慢且培養性狀異常；對黑脛病菌的抑制表現為菌絲生長稀疏且菌落生長遲緩，而對照菌落生長正常（圖1-A、1-B）。培養6 d的黑脛病菌和赤星病菌菌絲生長速率的測定結果如圖2。從圖中可以看出，該抑菌揮發物對兩種供試病原菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用，抑制率隨時間的延長而增長，對峙培養8 d時，對黑脛病菌和赤星病菌的菌絲生長抑制率分別為67.04%和70.00%。鏡檢觀察顯示，揮發物處理后的黑脛病菌生長緩慢、稀疏，菌絲扭曲、分枝增多且斷裂；經揮發物處理的赤星病菌菌絲畸形，其上不產生分生孢子梗，內含物聚集成團導致菌絲粗細不均、縊縮。

圖1 揮發性有機物對煙草赤星病菌（A）和黑脛病菌（B）的抑菌活性

2.2 揮發性有機物對供試病原菌孢子萌發的影響

赤星病菌菌分生孢子經抑菌揮發性有機物處理后萌發受到抑制，且延遲萌發后的芽管生長緩慢、短小畸形，大部分分生孢子畸形，表現為各分隔處的細胞腫脹成圓球狀泡或其他不規則形，而對照孢子均正常萌發且芽管生長正常。經揮發性有機物處理后的黑脛病菌產生的孢子囊數量明顯減少游動孢子萌發延遲，且萌發后芽管比空白對照生長緩慢。

2.3 揮發性有機物抑菌活性的離體葉片測定

揮發性有機物抑菌試驗結果如表1和圖3，培養至40 h和80 h，對照葉片的病斑擴散迅速，黑脛病發病率為92.50%，病斑表現為水浸狀斑塊沿接種點向周圍擴散為近圓形，病斑直徑平均為25.10 mm；經揮發物處理后葉片發病率為70.83%，病斑直徑的平均值為9.45 mm，揮發物對黑脛病斑擴散的抑制率為62.35%。對照葉片赤星病的發病率為88.33%，病斑擴散為近圓形的褐色壞死斑，平均直徑為8.32 mm；經揮發物處理后赤星病的發病率為60.80%，病斑擴展較慢，平均直徑為2.85 mm，揮發物對赤星病斑擴散的抑制率為65.75%。

圖2 揮發性有機物對煙草赤星病菌和黑脛病菌菌絲生長的影響

2.4 基于SPME GC-MS技術獲得AR03抑菌揮發性有機物總離子流圖

將上述獲得的吸附揮發物的萃取頭，在全掃描模式下進行分析，得到正構烷烴（C10-C20）、空白樣品揮發物和細菌揮發性有機物的總離子流圖（圖4-A、4-B、4-C）。根據前期試驗結果，初步判定AR03產生的抑菌代謝混合物為倍半萜烯類物質（C15H24），本方法選用結構式相近的1-十五烯為內標物（C15H30），因其屬性與目標代謝物相似，在色譜圖中出峰時間比較接近，且經檢驗AR03抑菌揮發代謝物在十五烯的保留時間內，無干擾峰出現（圖4-A）。將GC-MS采集的AR03揮發物總離子流圖，扣除空白樣品揮發物總離子流圖中共有色譜峰（圖4-B），即為揮發性有機物特征指紋峰（圖4-C），該菌體分泌的抑菌揮發性有機物共為7種，色譜峰出現的時間相對集中于22—25 min，主要成分為保留時間24.72 min的一種化合物，相對含量很高，而其他各物質含量相對較低，且各揮發物間不存在重疊性。

A：對赤星病的抑制效果Inhibition effect on tobacco brown spot；B：對黑脛病的抑制效果Inhibition effect on tobacco black shank

表1 AR03菌株分泌的揮發性有機物對煙草黑脛病和赤星病的防治效果

A：正構烷烴（C10-C20）總離子流圖Total ion flow diagram of n-alkanes (C10-C20)；B：空白基質揮發物總離子流圖Total ion flow chart of volatile matter in blank matrix；C：AR03揮發物總離子流圖Total ion flow chart of volatile matter in AR03

2.5 揮發性有機物的定性與定量分析

將2.4中獲得細菌揮發物總離子流圖，扣除空白樣品揮發物總離子流圖中共有色譜峰，即為AR03菌株釋放的揮發性特征指紋峰。計算每個色譜峰的保留指數，結合使用NIST和WILIY譜庫，對總離子圖中色譜峰進行定性識別，設置匹配度閾值為80，AR03抑菌揮發代謝物定性匹配結果見表2，該菌株分泌的抑菌揮發物共7種且均為C15H24結構的倍半萜烯類化合物，根據色譜峰出現的先后順序分別為二氫姜黃烯、()--金合歡烯、-姜黃烯、-姜烯、-紅沒藥烯、-倍半萜水芹烯和--紅沒藥烯；內標1-十五烯在色譜圖中出峰時間比較接近，且經檢驗AR03抑菌揮發性有機物在十五烯的保留時間內。

2.6 不同生長期AR03揮發性有機物定量分析

AR03菌株分別培養1、3和6 d后，其分泌的抑菌揮發性有機物相對含量有一定差異（表3），且隨著時間的延長呈遞減趨勢，當細菌培養1 d時，揮發物各組分相對含量最高，尤其是-倍半萜水芹烯的分泌量高達112.01 ng，占總含量的80.64%，其次為()--金合歡烯和-姜烯，相對含量分別為7.20%和6.67%；培養至3 d時，除了二氫姜黃烯含量小幅度升高外，揮發物其他各組分相對含量均逐漸降低，培養至6 d時，相對含量減少50%左右，各組分含量下降較明顯。

表2 AR03菌株抑菌揮發性有機物的鑒定

表3 AR03菌株揮發性有機物組分定量分析

3 討論

能分泌抑菌揮發性有機物的細菌在微生物界普遍存在，Zou等[23]隨機選擇1 018種細菌中，有328株細菌可以產生抗真菌的揮發性物質。與非揮發性抗菌物質相比，揮發性抑菌物質分子小，更易于在土壤和環境中滲透和擴散，能更全方位地殺滅環境中的病原菌，并能通過調節激素的代謝促進植物生長[24]。在植物病害生物防治中，細菌分泌抗真菌性揮發物質的鑒定及其應用是由Fernando等[25]首次報道，分離自大豆根部的綠針假單胞菌（）PA-23揮發物在體外和土壤中能抑制核盤菌（）菌絲生長及子囊孢子和菌核的萌發，凹玻片萌發法測定結果顯示揮發物對子囊孢子萌發的抑制率為54%—90%；本研究中的短小芽孢桿菌AR03菌株產生的揮發物對煙草黑脛病菌和赤星病菌菌絲、菌落生長和孢子萌發具有不同程度的抑菌和致畸作用，結合AR03菌株先前的研究結果分析其活性物質，該菌株產生胞外抑菌揮發物與其拮抗活性緊密相關，且是該菌株對黑脛病菌和赤星病菌拮抗機制的關鍵因子。揮發性有機物是很理想的信息化學物質，由于它們的易擴散性，揮發物的活動范圍可以從近處的互作擴展到更遠的距離[26]。本試驗中，AR03菌株分泌的抑菌揮發物利用其擴散的特性，抑制了離體葉片上病斑的擴展，從而減輕病害發生。在煙草生產上，可以將菌株施入土壤或噴施在葉片上，產生的抑菌揮發物在土壤或煙株周圍的環境中擴散進而充分保護煙株根部或葉片免受病原菌的侵染。

細菌在代謝過程中產生的揮發性物質種類較多，Kai等[11]通過頂空收集法和GC-MS技術分析了不同細菌產生的揮發性物質，發現不同的細菌能分別產生1—30種不同組分的揮發性化合物。已有很多研究報道了關于揮發性有機物具有抗植物病原真菌的活性，例如三甲胺（trimethylamine）抑制白地霉（）菌絲生長和孢子形成[27]，Almenar等[28]鑒定了spp.產生的14種不同的揮發物，包括二乙基己醇（2-ethyl-hexanol）、對羥基苯甲醛（4-hydroxybenzaldehyde）和壬酮（2-nonanone）等抗真菌揮發物；Arrebola等[29]采用GC-MS技術檢測分析拮抗果實采后病菌青霉（）的枯草芽孢桿菌PPCB01和解淀粉芽孢桿菌PPCB04產生揮發性抑菌物質，PPCB01菌株產生21種不同類型的揮發物，而PPCB04菌株產生8種不同的揮發物，其中3-羥基-2-丁酮是主要抑菌成分，含量分別為45.98%和97.52%。在本研究中，采用將AR03菌株產生的揮發性有機物經頂空收集采樣并進行GC-MS定性和定量分析，省去了普遍采用有機溶劑萃取的步驟，避免了有機溶劑不能完全萃取到所有揮發物質的缺點。GC-MS分析表明，AR03菌株產生7種C15H24結構的倍半萜烯類物質。相關研究表明，大多數倍半萜烯化合物具有芳香和重要的生物活性，是研究天然產物和開發新藥物的重要來源，廣泛存在于生姜（）[30]、人參（）[31]、刺芹屬植物[32]及中藥假鷹爪（）果實[33]等植物體中，本研究報道了來源于微生物次級代謝產物的倍半萜烯類化合物，為挖掘和開發具有藥用前景的倍半萜烯提供了新的微生物資源和途徑。

天然產物在開發抗癌藥物中發揮著重要的作用，約80%的藥物來源于天然產物[34]。已有相關文獻報道本試驗中抑菌揮發物質的一些組分具有重要的生物活性，相對含量為80.64%的-倍半萜水芹烯是一種重要的香料和藥理活性物質，1984年首次發現于生長于冰島的早花百里香的揮發油中[35]；還存在于姜、艾草（）[36]及美國冷杉（）葉片和嫩枝的揮發油中[37]。近期，Tyagi等[38]從姜黃粉的酒精浸提物中分離獲得的-倍半萜水芹烯具有抗惡性細胞擴散的活性，能抑制人類白血病細胞、骨髓瘤細胞和結直腸癌細胞的增殖；通過細胞內酯酶活性、質膜完整性和細胞相試驗發現，該物質還可以高效地抑制癌細胞克隆形成和誘導細胞凋亡。另外一個相對含量較高的組分()--金合歡烯是一種重要的警報信息素，大多數蚜蟲都能產生和利用該種激素，它的揮發釋放參與蚜蟲間的化學聚集，特別是能干擾蚜蟲取食，可用于蚜蟲的生物防治[39-40]。AR03菌株揮發物中的-姜烯也具有重要的藥理活性，據Bou等[41]研究發現，從林生腳骨脆葉（）粗提精油中分離的-姜烯純品對人宮頸癌HeLa、U-87、Siha和HL60細胞系具有細胞毒素活性，但其抑制中濃度（IC50）比粗提精油高。本研究鑒定的倍半萜烯各組分的藥理活性尚需進一步驗證。

生物揮發性物質的釋放是動態的過程，在細菌生長的過程中，隨著時間的變化和培養基的消耗，揮發物質的種類和數量會發生變化[42-43]。本研究通過保留指數和以1-十五烯為內參測定AR03菌株不同培養時間產生揮發物的相對含量，發現隨著時間的延長，各組分種類不變，但相對含量呈降低趨勢，原因主要包括以下兩個方面：其一可能是細菌生長經過對數期、穩定期進入衰亡期，繁殖越來越慢，代謝活動減慢，代謝產物亦隨之減少；另一個可能原因是GC-MS分析揮發物除了倍半萜物質外，還含有戊二烯（C5H8），由于戊二烯含有含多種同分異構體（1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、反式-1,4-戊二烯等），這些異構體的質譜圖相似度極高，且在DB-5MS色譜柱中保留行為較差，出峰時間較早（在本文報道色譜條件下1.6 min出峰），無法準確確證。因此筆者推測揮發物中的倍半萜烯類物質具有化學不穩定性，隨著培養時間的延長，可能降解為單體戊二烯，加上該物質無生物活性，本試驗未對其進行分析。另外值得注意的是，先期的研究結果顯示，AR03發酵液對煙草赤星病菌分生孢子萌發有很強的抑制效果，經一定濃度含菌發酵液處理的分生孢子幾乎不萌發，而本試驗結果顯示，AR03產生揮發物對供試病原菌分生孢子萌發的抑制和致畸作用比發酵液的抑菌作用弱，因此，揮發物質的抑菌活性可能只是AR03菌株抑菌作用的一部分；另外，揮發物對分生孢子萌發的影響采用的凹玻片萌發法，因為分生孢子分散于無菌水中，揮發物無法直接作用于分生孢子從而不能充分發揮其抑菌活性；AR03菌株分泌的揮發物在密封的培養皿空間內分散后濃度低可能也是影響其抑菌活性的重要因素。

4 結論

經室內培養皿對扣熏蒸法、凹玻片萌發法和離體葉片抗病測定，基本確定短小芽孢桿菌AR03菌株分泌的揮發性有機物對煙草黑脛病菌和赤星病菌菌絲生長具有抑制和致畸作用，抑制黑脛病菌產生孢子囊并延遲游動孢子的萌發；抑制赤星病菌分生孢子的萌發并引致孢子畸形；同時抑制黑脛病菌和赤星病菌病斑在葉片上的擴展。SPME GC-MS分析表明，AR03能分泌二氫姜黃烯、()--金合歡烯、-姜黃烯、-姜烯、-紅沒藥烯、-倍半萜水芹烯和--紅沒藥烯7種C15H24結構的倍半萜烯類物質，其中-倍半萜水芹烯相對含量最高，其次為()--金合歡烯和-姜烯。短小芽孢桿菌AR03菌株有潛力作為開發抗真菌代謝物和新藥物的重要微生物資源。

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（責任編輯 岳梅）

Antimicrobial effect and components analysis of volatile organic compounds fromAR03

WANG Jing, CAO JianMin, CHEN DeXin, QIU Jun, WANG XiaoQiang, FENG Chao, WANG WenJing

(Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong)

【Objective】 The objective of this study is to determine the antimicrobial activity of volatile organic compounds (VOCs), produced from tobacco rhizosphere soilAR03 strain, and to analyze its main components.【Method】The antifungal effect of VOCs on the colony, mycelium growth and spore germination ofvar.andwas determined by a double Petri dish assay and cavity slide method. The control effect of VOCs on tobacco black shank and brown spot by leaf inoculation was determined. VOCs were collected by head-space solid phase microextraction (HS-SPME) and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Retention index (RI) and internal standard (IS) 1-pentadecence were used for qualitative and quantitative analysis.【Result】VOCs released fromAR03 strain had certain inhibitory effect on the two target pathogens, which showed that the mycelium ofgrew slowly and thinned, branches increased and twisted, and broke. The mycelium ofwas deformed and no conidial pedicle was produced on the mycelium. Most of the inclusions gathered together and caused the mycelium to dry and constricted. Growth of exposed fungus colonies was inhibited by VOCs, the inhibition rates of VOCs were 56.21% and 59.23%, 64.75% and 59.86%, 66.13% and 61.10%, 67.04% and 70.00%, respectively, againstandculturedin sealed plates for 2, 4, 6 and 8 dWhen the zoospores ofandascospores ofexposed to these volatile components for 6 h, the germination was delayed and the growth was slow. The number of sporocyst produced byobviously reduced. most conidiophores ofexpanded abnormally as cystic structure, indicating the fungicidal nature of the volatiles. Moreover, VOCs could significantly inhibit the disease severities of tobacco black shank and brown spot on leaves tests. Direct fumigation for 40 h and 80 h, black shank disease incidence was 92.50% on control and 70.83% on leaves treated by VOCs, the inhibitory of spot expansion was 62.35%. Brown spot disease incidence was 88.33% on control and 60.80% on leaves treated by VOCs, lesions expanded slowly and inhibitory rate was 65.75%. SPME GC-MS analysis showed that seven components of the volatiles were identified, all of which are sesquiterpenes with C15H24structure. They are dihydrocurcumene (CAS nO. 1461-02-5), ()--famesene (CAS nO. 18794-84-8),-curcumene (CAS nO. 451-55-8),-zingiberene (CAS nO. 495-60-3),-bisabolene (CAS nO. 495-61-4),-sesquiphellandrene (CAS nO. 20307-83-9) and--bisabolene (CAS nO. 53585-13-0). When AR03 was cultured for 1 d, the relative content of-sesquiphellandrene was the highest (80.64%), followed by ()--famesene and-zingiberene, the relative content was 7.20% and 6.67%, respectively. With the extension of culturing time, the species of each component were the same, but the relative content was different. Except for dihydrocurcumene, the content of other components showed a decreasing trend, when cultured for 6 d, other ingredients decreased more than 50%, besides dihydrocurcumene keeping relatively stable. 【Conclusion】VOCs produced byAR03 could develop an additive antifungal effect against fungal pathogens on tobacco.AR03 has potential as an important microbial resource for developing antifungal metabolites and new drugs.

AR03; volatile organic compounds;var.;; SPME GC-MS

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.0010

2017-11-03；

2017-12-18

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（1610232016012）、中國煙草總公司四川省公司重點科技項目（SCYC201604）、山東省現代農業產業技術體系煙草產業創新團隊（SDAIT-2）

王靜，E-mail：wangjing06@caas.cn。曹建敏，E-mail：caojianmin@caas.cn。王靜和曹建敏為同等貢獻作者。通信作者王靜