二甲雙胍對(duì)高葡萄糖環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

劉付俊業(yè) 吳共發(fā) 邱麗湞 曾宇婷 黃綺亭

隨著生活水平及飲食方式的變化，2型糖尿病與結(jié)腸癌的發(fā)病率日益增加，且兩者有共同的危險(xiǎn)因素，包括精碳水化合物而低纖維素飲食、中心性肥胖、高體質(zhì)指數(shù)、缺乏活動(dòng)等。流行病學(xué)也發(fā)現(xiàn)2型糖尿病與包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)，促使人們?cè)絹?lái)越關(guān)注糖尿病與結(jié)腸癌的關(guān)系。二甲雙胍廣泛用于2型糖尿病的治療，除發(fā)揮降低血糖作用外，還能降低2型糖尿病人的結(jié)腸癌發(fā)生率和改善其預(yù)后［1-2］，但其機(jī)制還未完全明確。引起結(jié)腸癌患者死亡的主要因素是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，上皮——間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）已經(jīng)被廣泛證實(shí)參與了惡性腫瘤包括結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究觀察二甲雙胍在高葡萄糖環(huán)境下對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480增殖和侵襲的影響，并觀察其對(duì)EMT標(biāo)志物的影響，初步探討二甲雙胍影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

材料與方法

一、一般材料

SW480細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院。鹽酸二甲雙胍、二甲基亞砜（DMSO）和Matrigel膠均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，E-cadehrin、Vimentin和β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，辣根酶標(biāo)記抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，標(biāo)準(zhǔn)蛋白、ECL反應(yīng)檢測(cè)試劑盒、全蛋白提取試劑盒、蛋白濃度檢測(cè)試劑盒和Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司，胎牛血清、DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，D-無(wú)水葡萄糖購(gòu)自廣州達(dá)爾斯科公司，胰酶購(gòu)自南京凱基公司。

二、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組葡萄糖濃度為0 mmol/L，高糖組含葡萄糖終濃度為20 mmol/L，在高糖基礎(chǔ)上分別加終濃度為1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L的二甲雙胍干預(yù)處理為高糖干預(yù)組一，高糖干預(yù)組二，高糖干預(yù)組三，高糖干預(yù)組四，高糖干預(yù)組五。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，細(xì)胞5 000個(gè)/孔接種至96孔板，培養(yǎng)液終體積100 μl/孔，細(xì)胞貼壁按照上述分組進(jìn)行處理，同時(shí)與實(shí)驗(yàn)孔平行設(shè)置不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后每孔加10 μl CCK-8，置于培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，放在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm 處測(cè)定各組細(xì)胞孔的吸光度（absorbance，A）值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔計(jì)算平均值。各實(shí)驗(yàn)孔吸光度平均值減去平行空白對(duì)照孔的吸光度平均值后，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率，取細(xì)胞增殖抑制率為50%的二甲雙胍濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。抑制率（%）=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組）×100%

三、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell小室的下室加入500 μl培養(yǎng)液，加100 μl SW480細(xì)胞懸液于Transwell小室的上室加100 μl SW480細(xì)胞懸液。對(duì)照組及高糖組設(shè)置同上，以增殖抑制率為50%的二甲雙胍濃度處理高糖培養(yǎng)的細(xì)胞（高糖＋二甲雙胍組）及無(wú)高糖培養(yǎng)的細(xì)胞（二甲雙胍組）48h后，取出Transwell小室，用95%乙醇固定濾膜，蘇木素染色。棉簽拭去濾膜上室面的細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)Matrigel膠細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)3復(fù)孔，每組分別設(shè)定無(wú)Matrigel 膠的孔作為空白對(duì)照，計(jì)算癌細(xì)胞體外侵襲指數(shù)，計(jì)算方法如下：癌細(xì)胞體外侵襲指數(shù)（%）=該組穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)/該組空白對(duì)照穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。

四、Western blot

各組細(xì)胞處理48 h后離心收集，提取細(xì)胞蛋白并測(cè)定蛋白含量，每泳道40 μg蛋白等質(zhì)量上樣，經(jīng)過(guò)10%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，印跡膜在含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液內(nèi)室溫封閉1 h，加入一抗（E-cadheirn和Vimentin的稀釋度均為1：1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加人1：5 000稀釋的辣根酶標(biāo)記抗兔IgG，室溫震蕩孵育1 h，PBST洗膜采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)對(duì)照。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)采用方差齊性檢驗(yàn)和單向方差分析，多重比較采用LSD法分析，方差不齊采用Dunnett′s T3法，雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、高糖環(huán)境對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖組SW480細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后，各時(shí)間段的A值均明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別t=-20.718，P＜ 0.001；t=-33.439，P＜ 0.001；t=-67.018，P＜0.001；圖1），說(shuō)明高糖在不同時(shí)間段均能促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖。

圖1 高糖組與對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖情況

二、不同濃度二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境下SW480細(xì)胞的抑制作用

在高糖環(huán)境下，加入1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L濃度的二甲雙胍干預(yù)處理后，CCK-8結(jié)果顯示，除了1 mmol/L濃度在24 h對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響外，其余不同濃度的二甲雙胍在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均對(duì)SW480細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，A值明顯減低，呈時(shí)間——?jiǎng)┝恳蕾?lài)性（F=826.820，均P＜0.001，圖2）。計(jì)算顯示當(dāng)20 mmol/L作用48 h其抑制率為50%，故以下實(shí)驗(yàn)設(shè)置該濃度及時(shí)間點(diǎn)。

圖2 不同濃度二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境下SW480細(xì)胞的增殖影響

三、二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境下SW480細(xì)胞侵襲影響

單向方差分析顯示各組間的細(xì)胞侵襲指數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.403，P＜0.001），進(jìn)一步多重比較分析顯示高糖＋二甲雙胍組細(xì)胞侵襲指數(shù)為（40.18±2.22）%，顯著低于高糖組的（66.16±5.52）%（P＜0.001），二甲雙胍組的侵襲指數(shù)為（34.94±2.13）%，顯著低于對(duì)照組（52.21±2.63）%（P＜0.001），高糖＋二甲雙胍組與二甲雙胍組的侵襲指數(shù)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.098）。

四、二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境下SW480細(xì)胞EMT標(biāo)記物表達(dá)的影響

Western bolt結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高糖環(huán)境能增加EMT標(biāo)記物表達(dá)，表現(xiàn)為E-cadherin蛋白表達(dá)降低，Vimentin蛋白表達(dá)增強(qiáng)；與對(duì)照組及高糖組比較，二甲雙胍在有或無(wú)高糖環(huán)境下均能抑制SW480細(xì)胞EMT標(biāo)記物表達(dá)，表現(xiàn)為E-cadherin蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Vimentin蛋白表達(dá)減低（圖3）。

圖3 二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞EMT標(biāo)記物的表達(dá)影響

討 論

2型糖尿病和癌癥是全世界范圍內(nèi)引起人類(lèi)死亡的最常見(jiàn)疾病。2型糖尿病本身不僅是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的慢性消耗性炎性反應(yīng)疾病，而且還能夠增加癌癥疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，其中包括結(jié)腸癌［3］。作為治療2型糖尿病的一線用藥，二甲雙胍證實(shí)除了能發(fā)揮降血糖的作用外，流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)其還能降低糖尿病患者的結(jié)腸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)以及改善患者預(yù)后［1，4］。目前，二甲雙胍抗腫瘤作用的機(jī)制尚不完全清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與其降低血糖的間接作用機(jī)制相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察二甲雙胍在高葡萄糖環(huán)境下對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480增殖和侵襲的影響，初步探討其可能的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖環(huán)境可以刺激結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，在加入二甲雙胍處理后，細(xì)胞增殖活性受到抑制，而且，無(wú)糖環(huán)境下的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性同樣受到抑制。這提示二甲雙胍抑制腫瘤的生長(zhǎng)可能不單純通過(guò)降低血糖的間接作用所致，其本身可能存在直接的抗腫瘤活性。Zakikhini等［5］早先通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29的生長(zhǎng)。而后Tomimoto等［6］動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了二甲雙胍抑制小鼠腸息肉的生長(zhǎng)并非由于二甲雙胍的間接作用。國(guó)內(nèi)朱等［7］報(bào)道二甲雙胍能抑制無(wú)高糖培養(yǎng)的SW480細(xì)胞的增殖，我們結(jié)果與之相符合。但有報(bào)道稱(chēng)在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的SW480細(xì)胞中單獨(dú)加入二甲雙胍不能抑制細(xì)胞增殖［8］。在其他腫瘤，目前許多體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二甲雙胍能對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖的作用［9-10］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，高糖環(huán)境能刺激增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力，增加EMT標(biāo)記物表達(dá)，表現(xiàn)為E-cadherin蛋白表達(dá)降低，Vimentin蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而二甲雙胍不但能抑制高糖環(huán)境結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力，而且對(duì)無(wú)糖環(huán)境的對(duì)照組結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力同樣具有抑制作用，并均能抑制有或無(wú)高糖環(huán)境下的結(jié)腸癌細(xì)胞EMT標(biāo)記物的表達(dá)。結(jié)腸癌患者的主要死亡因素是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的基本過(guò)程，是非侵襲性腫瘤向高侵襲性腫瘤轉(zhuǎn)換所必需的，腫瘤發(fā)生EMT后，上皮標(biāo)志物如E-cadherin表達(dá)下降，間質(zhì)標(biāo)志物如Vimentin表達(dá)升高［11］。二甲雙胍在多種惡性腫瘤如胃癌［12］、肺腺癌［13］等均能抑制EMT。國(guó)內(nèi)研究報(bào)道二甲雙胍能抑制晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的大腸癌EMT［8］。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能抑制高糖或無(wú)糖環(huán)境下的結(jié)腸癌細(xì)胞EMT，可能是二甲雙胍抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的重要機(jī)制。

綜上所述，高葡萄糖環(huán)境能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和具有更強(qiáng)的EMT作用，二甲雙胍能明顯抑制有或無(wú)高葡萄糖環(huán)境下結(jié)腸癌的增殖、侵襲能力以及EMT。雖然二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制增殖、侵襲和EMT的作用，但對(duì)于無(wú)糖環(huán)境下的結(jié)腸癌細(xì)胞同樣具有抑制增殖、侵襲和EMT的作用，我們推測(cè)二甲雙胍的抗腫瘤特性不僅通過(guò)降血糖的間接作用所致，可能二甲雙胍還具有直接的抗腫瘤特性，深入闡明二甲雙胍的抗腫瘤機(jī)制，對(duì)應(yīng)用二甲雙胍治療糖尿病相關(guān)惡性腫瘤具有重要意義。

[1]Lee MS, Hsu CC, Wahlqvist ML, et al. Type 2 diabetes increases and metformin reduces total, colorectal, liver and pancreatic cancerinc idences in Taiwanese： a representative population prospective cohort study of 800, 000 individuals [J]. BMC Cancer, 2011, 11： 20

[2]Nie Z, Zhu H, Gu M. Reduced colorectal cancer incidence in type 2 diabetic patients treated with metformin： a meta-analysis [J].Pharm Biol, 2016, 54(11)： 2636-2642.

[3]de Kort S, Simons CC, van den Brandt PA, et al. Diabetes mellitustype 2 and subsite-specific colorectal cancer risk in men and women： results from the Netherlands Cohort Study on diet and cancer [J]. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2016, 28(8)： 896-903.

[4]Coyle C, Cafferty FH, Vale C, et al. Metformin as an adjuvant treatment for cancer： a systematic review and meta-analysis [J]. Ann Oncol, 2016, 27(12)： 2184-2195.

[5]Zakikhani M, Dowling RJ, Sonenberg N, et al. The effects of adiponectin and metformin on prostate and colon neoplasia involve activation of AMP-activated protein kinase [J]. Cancer Prev Res(Phila), 2008, 1(5)： 369-375.

[6]Tomimoto A, Endo H, Sugiyama M, et al. Metformin suppresses intestinal polyp growth in ApcMin/＋mice [J]. Cancer Sci, 2008, 99(11)：2136-2141.

[7]朱智峰, 梁琳瑯. 二甲雙胍對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響 [J]. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 41(2)： 115-119.

[8]郭娜, 逢曙光. 二甲雙胍抑制晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 [J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2015, 35(19)：5374-5377.

[9]Ben Sahra I, Laurent K, Loubat A, et al. The antidiabetic drug metformin exerts an antitumoral effect in vitro and in vivo through a decrease of cyclin D1 level [J]. Oncogene, 2008, 27(25)： 3576-3586.

[10]王靜璐, 史惠蓉, 謝婭, 等.二甲雙胍對(duì)不同分化程度的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)作用機(jī)制 [J]. 中華婦產(chǎn)科雜志,2015, 65(9)： 685-691.

[11]Yeung KT, Yang J. Epithelial-mesenchymal transition in tumor metastasis [J]. Mol Oncol, 2017, 11(1)： 28-39.

[12]Valaee S, Yaghoobi MM, Shamsara M. Metformin inhibits gastric cancer cells metastatic traits through suppression of epithelialmesenchymal transition in a glucose-independent manner [J]. PLoS One, 2017, 12(3)： e0174486.

[13]Zhao Z, Cheng X, Wang Y, et al. Metformin inhibits theIL-6-induced epithelial-mesenchymal transition and lung adenocarcinoma growth and metastasis [J]. PLoS One, 2014, 9(4)： e95884.