PLAGL2與結腸癌侵襲能力的相關性研究

丁秀杰 王永鵬 馬思平 張睿 王燕 張慶彤 張昊 李鵬雷 林濤 李巖溪 陳玉澤 劉放

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，目前其死亡率在所有惡性腫瘤中已經上升到第2位［1］。2015年美國全年新發結直腸癌病例約132 700例，同年死亡病例約49 700例［2］。結直腸癌的發展過程中，約有50%的患者最終出現肝轉移，20～30%患者出現肺轉移，浸潤和轉移是結直腸癌患者致死的主要因素［3］。結直腸癌發生與發展是一個多基因參與、多因素相互作用、經過多個階段最終形成的、極其復雜的生物學現象［4-5］。上皮——間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）目前被認為是腫瘤侵襲的主要機制而被廣泛研究。它是一種潛在的類似胚胎發育的過程，包括上皮標志丟失，同時伴隨著許多間質性標志表達增加，如神經鈣粘附素、波形蛋白等。其在腫瘤進展過程中可以異常再激活，為細胞提供侵襲性和運動性的能力，通常被視為轉移傳播的一個主要的驅動力［6］。良好的腫瘤標志物監測腫瘤細胞播散轉移對我們了解病人病理事件的發生順序顯得尤為重要。

多形性腺瘤基因樣因子2（pleomorphic adenoma gene-like 2，PLAGL2）是一類來源于PLAG基因家族的鋅指蛋白，其分子結構式的N端含7個C2H2鋅指蛋白結構域。目前已證實，人和鼠PLAGL2基因的DNA序列有92%同源性，人類PLAGL2基因在胎兒期表達豐富，小鼠肺，脾和睪丸組織中的表達水平最高［7］。臨床上PLAGL2與惡性腫瘤的關系首先在急性髓性白血病和肺癌中被人研究，從其與肺良性疾病的研究中延伸而來，逐漸引起人的重視。本文擬從組織學水平以及細胞實驗探討PLAGL2蛋白表達與結腸癌發生發展及侵襲的關系及機制。

資料與方法

一、研究對象

選取2015年10月15日至2015年12月10日期間遼寧省腫瘤醫院結直腸外科收治的結腸癌患者40例，納入研究對象如下：（1）初診為結腸癌患者，未經過術前放化療或者其他生物免疫治療；（2）無合并其他惡性腫瘤；（3）入組患者年齡：51～87歲；（4）根據醫學倫理學原則，研究前應對研究對象進行告知，確保所有研究對象充分了解相關信息，并簽署知情同意書。

二、免疫組化

從福爾馬林固定的組織中切取4～6 μm厚切片，進行石蠟包埋，然后在二甲苯和一系列濃度的乙醇中進行脫蠟。組織切片在0.3%過氧化氫溶液內孵育12 min，以阻止內源性過氧化物酶活性。切片在蒸汽壓力鍋里煮沸的檸檬酸緩沖液（pH值6）中孵育以提取抗原。然后樣本與山羊血清在室溫孵育30 min。阻斷特異性抗體后，樣本與抗PLAGL2多克隆抗體（Abcam公司，美國）在1：200稀釋濃度下在4 ℃培養過夜。然后滴加適量生物素標記的二抗，37 ℃孵育20 min。PBS沖洗3 次，每次5 min。最后滴加適量的HRP標記鏈霉親和素，37 ℃孵育30 min。PBS 沖洗3次，每次5 min。顯色劑顯色10 min。自來水沖洗，蘇木素復染色，脫水，透明，封片。觀察PLAGL2蛋白的表達情況。

三、細胞實驗

（一）pcDNA3.1-PLAGL2質粒構建

（1）基因擴增：建立PCR反應體系，進行目的基因片段PCR擴增，電泳檢測擴增情況。利用多功能DNA純化回收試劑盒提取純化的目的基因片段；（2）TA克隆：將得到的目的基因與pUM-T simple vector連接，經過系列反應以后，形成單菌落。挑選白色菌落，PCR鑒定插入片段長度，選取陽性克隆，標記為T-PLAGL2，測序；（3）質粒提取：利用質粒大量制備試劑盒提取目的質粒（T-PLAGL2，pcDNA3.1）；（4）基因重組：根據實驗設計的酶切位點對T-PLAGL2，pcDNA3.1質粒進行雙酶切，回收酶切片段，將得到的目的基因與pcDNA3.1連接。挑選菌落，PCR鑒定插入片段長度，選取陽性克隆，標記為pcDNA3.1-PLAGL2，測序。

（二）細胞培養、轉染及篩選

SW480細胞貼壁生長于含10%胎牛血清、青霉素100 u/mL、鏈霉素100 ug/mL的IMDM培養液中，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫密閉培養箱內傳代培養，培養SW480細胞至密度為90%左右，在6孔板中利用轉染試劑脂質體2000進行轉染PLAGL2質粒及空載體Vector質粒。轉染24 h后，6孔板內每孔加入含有200 μg/mL G418的DMEM完全培養基進行篩選。篩選后的細胞株經傳代后，與未轉染的SW480細胞分三組：SW480、Vector和 PLAGL2，應用 Western-blot方法在蛋白水平進行檢測，檢驗轉染效率及穩定性。

（三）Transwell細胞侵襲實驗

首先將Matrigel膠包被到小室膜上，建立Transwell小室模型。將SW480、Vector、PLAGL2各組細胞培養至密度為90%左右，胰酶消化后制成細胞懸浮溶液放入上室，下室放入含20%FBS培養液。培養24小時固定染色，顯微鏡下觀察、計數。

（四）Western-blot

分SW480、Vector和PLAGL2三組細胞進行實驗，每組至少5個單獨樣本檢測。先對檢驗的樣本進行總蛋白抽提，蛋白質定量。然后按實驗分組進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉印至PVDF膜，然后封閉。選擇相關目的基因抗體孵育一抗，用羊抗兔IgG-HRP進行二抗孵育，待ECL底物發光，圖像保存。內參用β-actin，實驗步驟一致。條帶的光密度通過Gel-Pro分析儀（Media Cybernetics公司，美國）進行數據分析，以目的蛋白與β-actin光密度的比值進行統計學比較。

四、統計學分析

本文所有數據資料均使用SPSS for Windows 20.0軟件處理。結果以均數±標準差（SD）表示，計量資料采用兩樣本t檢驗或單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較組間均數，計數資料采用χ2檢驗、χ2連續校正或者Fisher確切概率法進行分類資料分析，以雙側檢驗P＜0. 05為差異有統計學意義。

結 果

一、PLAGL2在結腸癌組織中的表達情況

免疫組化染色結果需要兩位病理科醫生通過半定量方法進行評估。細胞陽性染色強度評分：分為無色0，淡黃色1、棕黃色2和暗褐色3；每高倍視野計數100個細胞，判斷陽性細胞比例：分為無陽性細胞0，陽性細胞＜15%為1，15～50%為2，51～75%為3，＞75%為4。細胞陽性染色強度與陽性細胞比例乘積為免疫反應評分（immunoreactivity score，IS）：0為陰性、1～4為弱陽性、5～8為中陽性，9～12為強陽性，陰性和弱陽性定義為低表達，反之則為高表達（圖1）。

40例免疫組化標本中，14例為Ⅰ～Ⅱ期結腸癌組織，26例為Ⅲ～Ⅳ期，同時配對40例癌旁組織。比較免疫反應評分（IS值），PLAGL2蛋白在Ⅲ～Ⅳ期結腸癌組織中表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期結腸癌組織，更高于癌旁組織，分別為8.120±2.997、5.710±2.494、2.170±0.984。三組之間比較以及兩兩比較差異均有統計學意義（表1）。

二、PLAGL2的表達與臨床病理因素的關系

按照IS評分，陰性和弱陽性（0～4分）為低表達，中陽性和強陽性（5～12分）為高表達，將40例病例按照PLAGL2的表達水平分為高低兩組，進行對照分析。卡方檢驗結果提示PLAGL2表達增高的患者臨床分期較晚（χ2=5.700，P=0.017）、腫瘤較大（χ2=8.174，P=0.008）以及更易發生遠隔臟器轉移（χ2=13.610，P＜0.001）（表2）。

三、pcDNA3.1-PLAGL2質粒的成功構建

對構建好的pcDNA3.1- PLAGL2質粒進行電泳及鑒定測序，泳道1（M）為D2000 marker，泳道2（質粒）為重組質粒pcDNA3.1-PLAGL2，泳道3（單酶切）為用BamHI對質粒pcDNA3.1-PLAGL2進行單酶切，泳道4（雙酶切）為用BamHI/EcoRI對質粒pcDNA3.1-PLAGL2進行雙酶切（圖2）。PLAGL2目的基因片段大小約為1 900 bp，測序結果與Genebank上公布的序列基本吻合。

圖1 PLAGL2在不同分期結腸癌和癌旁組織中的表達情況（400×）：1A圖為癌旁組織、1B～E圖為Ⅰ～Ⅳ期結腸癌組織，PLAGL2表達依次升高且表達位置主要在細胞漿中

表1 結腸癌組織和癌旁組織中IS值的比較

四、PLAGL2高表達穩轉SW480細胞系的建立

質粒pcDNA3.1-PLAGL2轉染至SW480結腸癌細胞株，經過穩定生長、傳代、凍存、復蘇之后，通過Western-blot檢測PLAGL2的表達情況，結果顯示PLAGL2組細胞株PLAGL2蛋白表達明顯高于SW480組和Vector組，證明轉染成功（圖3）。同樣分SW480、Vector、PLAGL2三組進行細胞培養并觀察，細胞為單層貼壁生長，同樣呈上皮細胞形態，三組細胞形態無顯著變化，觀察7日內的細胞增殖變化，PLAGL2組比SW480、Vector兩組略高，但差異尚無統計學意義（P＞0.05）（圖4）。

表2 PLAGL2與臨床病理因素的相關性

五、Transwell侵襲實驗結果

用倒置顯微鏡觀察侵襲的細胞，并分組計算細胞個數的平均值，SW480、Vector和PLAGL2三組分別為84.60、81.00和122.60，經兩兩比較，PLAGL2組與另兩組差異有顯著統計學意義（F=27.997，P＜0.01）（圖5）。

圖2 酶切片段電泳結果（泳道1為D2000 marker；泳道2為重組質粒pcDNA3.1-ILE1；泳道3為用BamHI對質粒pcDNA3.1-ILE1進行單酶切；泳道4為用BamHI/EcoRI對質粒pcDNA3.1-ILE1進行雙酶切）

圖3 穩轉后SW480細胞行Western-blot結果

圖4 細胞增殖曲線

圖5 Transwell法觀察三組細胞的侵襲能力：上圖為遷移至微孔膜下層的細胞情況，由左到右依次為SW480、Vector和PLAGL2（200×）；下圖為穿透細胞個數比較（**P＜0.01）

六、EMT標志物的表達情況

應用Western-blot對SW480、Vector和PLAGL2三組細胞進行5次獨立樣本實驗，計算目的蛋白E-cadherin、vimentin和MMP-7與β-actin的灰度比值（均數±標準差）進行統計學分析，E-cadherin表達顯著下降（F=38.461，P＜0.01）而vimentin（F=28.741，P＜0.01）和MMP-7（F=24.520，P＜0.01）均有升高，表達差異有顯著統計學意義（圖6）。

討 論

PLAGL2是多形性腺瘤基因鋅指蛋白家族成員之一，其他成員包括PLAGl和PLAGLl。PLAG蛋白家族作為細胞核轉錄調控因子，在多種基因表達中起到重要調控作用，比如細胞的生理性增殖以及病理性的腫瘤發生。Zheng H等［8］通過在神經干細胞（neural stem cell，NSC）和神經膠質瘤啟動細胞（GIC）細胞株中增強PLAGL2表達，發現PLAGL2基因能夠強烈抑制細胞分化，增強其自我更新的能力，并賦予惡性腫瘤細胞某些干細胞的特性，具體機制可能與通過調節Wnt信號通路而阻礙細胞分化有關。PLAGL2蛋白與結直腸癌相關的研究文獻不多，Liu等［9］通過對225例臨床結直腸癌標本以及66例癌旁組織進行檢測，同時回顧性分析225例患者的臨床病理學特征，發現結直腸中PLAGL2的表達水平明顯高于癌旁正常組織，且與腫瘤浸潤深度密切相關。除此之外，還有很多研究已經闡明PLAGL2是作為一個轉錄因子，其過表達可能會促進腫瘤的進展［10-12］。在我們的研究中，我們首先通過40例患者的病例資料及組織學標本進行檢測。免疫組化結果證明隨著結腸癌臨床分期增加，PLAGL2 的表達顯著增加，晚期癌患者的上調尤為明顯。分析PLAGL2的表達與臨床病理因素之間的關系，與腫瘤分期、腫瘤大小以及有無轉移密切相關，而與組織學類型并無關系。以上結果，從病理學檢測以及臨床病理因素的回顧性分析兩個層面說明PLAGL2在結腸癌的細胞增殖、侵襲及轉移等方面起到重要作用，但與結腸癌細胞本身生物學惡性程度關系不大。PLAGL2很可能會成為新的判斷結腸癌分期及預后的標記物，同時也進一步確認和驗證了之前文獻對PLAGL2的研究結果［9］。

接著我們的研究從組織水平進入到細胞實驗，經過穩轉高表達PLAGL2的SW480細胞株成功建立并穩定傳代，為后續實驗提供了技術支持。Transwell侵襲實驗非常直觀的說明PLAGL2表達上調的結腸癌細胞的遷移和侵襲能力明顯增強，這很可能與誘發EMT機制相關。近年來，EMT機制廣泛應用于腫瘤學的研究，而越來越被人所重視。2002年法國腫瘤學家Thiery［13］提出腫瘤發展是一個復雜的、多基因參與的多階段過程，其中上皮間質轉化是個非常重要的步驟。Tiwari N等［14］通過研究表明，從良性腺瘤到惡性癌、以及癌的侵襲和轉移的過渡過程中，上皮性腫瘤細胞獲得去分化，遷移行為和侵襲的特征與EMT相關。而且EMT過程伴隨著細胞形態的巨大變化，同時伴隨細胞與細胞之間、細胞與基質之間連接物質的丟失和重塑，使得腫瘤細胞獲得遷移和侵襲的能力。Gu G等［15］通過對散發性結直腸癌和Lynch綜合癥的侵襲轉移能力進行對比分析，發現Lynch綜合癥侵襲能力弱于散發性結直腸癌，主要就是跟EMT機制強弱相關，其中EMT機制的發生包括上皮標志丟失，如黏附蛋白E-cadherin、β-catenin以及細胞角蛋白的丟失，同時伴隨著許多間質性標志表達增加，如N-cadherin、Vimentin以及MMP家族蛋白等。

圖6 Western-blot檢測三組細胞株的E-cadherin、vimentin和MMP-7的表達情況及光密度比值的對比分析（**P＜0.01）

由于經費有限，我們只選擇了與EMT相關的三個分子E-cadherin、Vimentin以及MMP-7從上皮細胞、間質、細胞外基質三方面進行研究。E-cadherin對細胞與細胞及細胞與基質之間的粘附及組織結構的維持起到重要作用。多種惡性腫瘤的分化程度降低、侵襲轉移能力增強以及預后不良和E-cadherin的表達缺失密切相關［16-19］。Vimentin是細胞支架的重要成分，能夠固定細胞器的位置，保持細胞的完整性［20］。在結直腸癌中vimentin常以甲基化形式存在，并且已被證實是結腸癌的生物標志物，同時也是EMT的標志物之一［21］。MMP-7是MMP家族中結構最小的成員，除了與MMP家族成員一樣能降解細胞外基質，還可以調節細胞凋亡、促進細胞生長、浸潤和轉移［22］。正常機體極少表達MMP-7，而主要在病理或生理過程中表達，如炎癥愈合、胚胎發育等等［23］。Sun等［24］通過對17個研究的2 985例結直腸癌患者進行薈萃分析，總結了MMP-7表達增高提示不良的總生存期和無病生存期，同時降低5年生存率。因此，MMP-7是結直腸癌患者預后不良和高復反風險的重要指標。我們的研究結果證實，PLAGL2高表達的SW480細胞株侵襲能力增強，EMT相關的上皮標志物E-cadherin表達顯著下降，間質標志物Vimentin以及細胞外基質標志物MMP-7表達明顯升高，尤其在MMP-7的表達中可以看到，SW480和Vector兩組表達很低，說明PLAGL2能夠促進MMP-7分子的轉錄并發揮生物學作用促進EMT形成。

綜上所述，本研究揭示了PLAGL2的表達上調與結腸癌的發生、發展密切相關，并且能夠提高結腸癌細胞的侵襲能力，故認為PLAGL2是結腸癌細胞EMT形成的重要調節因子，其表達上調以后影響EMT相關分子的表達。但目前確切的作用機制、所涉及的信號傳導通路等問題將在我們的課題中進一步研究。

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