米諾環素-鋅納米緩釋凝膠治療大鼠實驗性牙周炎效果觀察

王冬梅，王永學，楊熙晨，趙迎迎(新鄉醫學院第三附屬醫院，河南新鄉453003；新鄉醫學院生命科學技術學院)

牙周炎是細菌性感染引起的常見口腔疾病，致病菌以革蘭陰性厭氧菌為主，致病菌形成菌落并以菌斑形式沉積在牙間、牙面和修復體的表面，侵犯牙齦及牙周組織而導致慢性炎癥發生[1,2]。抑制并清除牙周組織致病菌落是治療牙周炎的重要途徑，機械清除被認為是最有效的治療方法[3]。但是牙周組織解剖形態復雜，存在一些器械難以到達的部位，操作死區較多，并且機械治療對牙周組織破壞嚴重，容易引起繼發性損傷[4]。米諾環素屬于四環素家族成員，是治療牙周的常用藥物，具有廣譜抗菌作用，能對抗牙周組織局部嚴重、抑制膠原酶活性及促進牙周組織再生[5]。鹽酸米諾環素軟膏(派力奧)由于作用面積、作用時間的局限性，不能在牙周組織發揮較好的抗菌作用，臨床應用效果不滿意。2016年3～10月，我們以鹽酸米諾環素為原料藥，融合微量殺菌功能元素鋅以及具有良好生物相容性的納米材料，制備持久、緩釋、高黏附的米諾環素-鋅納米緩釋凝膠，觀察其對大鼠實驗性牙周炎的治療效果。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 6月齡SD雄性大鼠30只，體質量(248±27)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。牙齦卟啉單胞菌ATCC33277購自四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室。派力奧購自Sunstar INC公司(日本)。

1.2 米諾環素-鋅納米緩釋凝膠制備 2%殼聚糖乙酸溶液和0.02 mmol/L硫酸鋅溶液等體積60～70 ℃水浴回流4 h，自然冷卻至室溫，獲得殼聚糖-鋅絡合物溶液。該溶液中加入適量米諾環素水溶液，攪拌均勻。持續攪拌下緩慢滴加三聚磷酸鈉(TPP)，體積比為7∶1，至溶液呈現乳白色終止滴加。無水乙醇沉淀微球，洗滌，冷凍干燥得含米諾環素的殼聚糖-鋅微球。預冷2%殼聚糖溶液和58%β-GP(4∶1)混合，調pH 7.0，然后添加含米諾環素的殼聚糖-鋅微球，攪拌均勻即可，終溶液中米諾環素濃度2%，鋅濃度1.25 μg/mL。4 ℃保存備用。上述混合液置于37 ℃水浴約3 min可形成凝膠。

1.3 大鼠實驗性牙周炎模型構建 30只大鼠均給予1%戊巴比妥鈉40 mg/kg行腹腔注射麻醉。采用0.3 mm正畸鋼絲，在左上頜第一磨牙近牙齦根方處行牙頸部結扎，持續1周。牙齦卟啉單胞菌ATCC33277溶于生理鹽水，均勻涂布至牙齦齦溝內，1次/周，持續6周。6周后可觀察到磨牙牙齦充血、紅腫，探診有血液溢出、牙周袋形成、牙齦溝液增加；取大鼠磨牙齦下菌斑進行細菌厭氧培養，可見菌落密集形成，認為牙周炎模型構建成功。

1.4 分組與干預方法 將模型大鼠隨機分為對照組、派力奧組、米諾環素凝膠組各10只。派力奧組以派力奧軟膏注入牙周袋內，至充滿為止；米諾環素凝膠組以米諾環素-鋅納米緩釋凝膠注入牙周袋內，至充滿為止；對照組以等體積生理鹽水注入牙周袋內，至充滿為止。每周用藥1次，連續4周。

1.5 觀察指標

1.5.1 治療前后牙齦菌落數 于治療前及完成治療后，用生理鹽水對大鼠炎癥磨牙沖洗30 s，使用無菌刮治器在牙齦3個位置取菌斑，厭氧環境下培養6 d。取黑色菌落，ImagePro-pus5.0計數牙菌斑總菌數、牙齦卟啉單胞菌數。

1.5.2 治療前后牙齦出血指數(SBI)、牙菌斑指數(PLI) ①SBI:治療前及治療后，將大鼠頭部固定，暴露大鼠患牙，探針探入牙齦溝內10 s，觀察牙齦溝出血情況。評分標準：探診無出血為0分；探診后點狀出血，牙齦無顏色改變，無水腫為1分；探診出血，牙齦出現顏色改變，無水腫為2分；探診出血，牙齦出現顏色改變，輕度水腫為3分；探診出血，牙齦出現顏色改變，水腫明顯為4分；自發性牙齦出血為5分。②PLI:治療前及治療后，在大鼠患牙牙面均勻涂抹2%堿性品紅溶液，生理鹽水沖洗3次，牙齦表面紫紅色即為菌斑位置。評分標準：牙齦無牙菌斑存在為0分，存在薄牙菌斑為1分，存在中等量牙菌斑為2分，存在大量牙菌斑為3分。

1.5.3 治療后牙齒松動度(TM)、牙槽骨喪失(ABL) ①TM:以治療后患牙向頰舌向松動為1分，患牙向頰舌向及近中遠中向均松動為2分，患牙向頰舌向及近中遠中向、垂直向均松動為3分。②ABL:治療后處死大鼠，除去上頜骨軟組織，于1 mol/L氫氧化鈉浸泡5～10 min，甲基藍染色以顯色釉牙骨質界，在20倍放大鏡下采用千分尺測量患牙釉牙骨質界與牙槽嵴頂的距離，取近頰點、頰點、遠頰點、近舌點、舌點和遠舌點6個測量值，以均值描述牙槽骨喪失值。

2 結果

2.1 三組牙齦菌落數比較 治療后米諾環素凝膠組與派力奧組牙菌斑總菌數均下降(P均<0.05)，米諾環素凝膠組牙菌斑總菌數、牙齦卟啉單胞菌數均低于派力奧組和對照組(P均<0.05)。見表1。

2.2 三組治療前后SBI、PLI比較 治療后派力奧組、米諾環素凝膠組SBI、PLI均下降，米諾環素凝膠組SBI、PLI低于派力奧組和對照組(P均<0.05)。見表2。

表1 三組牙齦菌落數比較(個，

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組同期比較，﹟P<0.05；與派力奧組同期比較，△P<0.05。

表2 三組治療前后SBI、PLI比較(分，

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組同期比較，﹟P<0.05；與派力奧組同期比較，△P<0.05。

2.3 三組治療后TM、ABL比較 治療后米諾環素凝膠組、派力奧組TM、ABL均低于對照組(P均<0.05)。米諾環素凝膠組TM、ABL均低于派力奧組(P均<0.05)。見表3。

表3 三組治療后TM、ABL比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與派力奧組比較，﹟P<0.05。

3 討論

牙周炎的致病菌以革蘭陰性厭氧菌為主，細菌表面物質、分泌的毒素、體內酶等不僅可直接或間接損傷牙周組織，而且還能激發宿主炎性免疫反應，引起組織細胞變性壞死、牙周膜纖維破壞、牙槽骨吸收等一系列損害，導致牙齦出血、牙周溢膿、牙齒過敏、牙齒松動甚至脫落等一系列癥狀[6]。牙周炎的治療主要包括機械和非機械性治療。機械治療是牙周炎主要治療方式[3]，但是由于牙周組織解剖形態復雜、操作難度大，嚴重影響機械治療的效果。抗菌藥物目前被廣泛用于口腔炎性疾病的治療，取得了一定效果[7]。但是抗菌藥物治療牙周炎存在用藥方式選擇的難題，全身用藥時只有一小部分藥物運送到牙周組織，治療濃度相對較低，難以最大限度發揮抗菌作用；而大劑量、長時間使用抗菌藥物又易引起不良反應，同時可導致菌群失調或耐藥菌株的產生[8]；如果采用含漱、沖洗、涂布等局部用藥方式，則藥物作用面積有限，并且在牙周停留時間較短，藥物滲透性差，影響抗菌效果[4]。

緩釋劑能夠使藥物緩慢、有控制地釋放到病變局部組織，可持續有效地作用于病變部位。由于藥物在局部緩慢釋放，從而避免了全身用藥所引起的細菌耐藥和不良反應。緩釋劑在保持牙周部有效抗菌藥物濃度的同時，還可以減少給藥次數，從而提高患者的依從性[9]。米諾環素在牙周炎過程中主要發揮抗菌作用，其對中間普氏菌、牙齦卟啉單胞菌、伴放線聚集桿菌等主要牙周致病菌均有抑制作用[10]。米諾環素是脂溶性抗菌藥物，滲透性強，除了能直接穿透細菌細胞壁與tRNA結合，達到抑菌效果還能外，還能抑制膠原酶活性、促進成纖維細胞附著，抑制骨吸收等作用[11]。鹽酸米諾環素的高效性和長效性，適宜制備緩釋劑用于牙周炎等局部炎性疾病的治療。鋅作為人體內所必需的元素，具有廣泛的生物學效應，局部高濃度的鋅對細菌具有直接殺滅作用[12]。鋅可與細菌內核酸、蛋白質中的巰基(-SH)、氨基(-NH2)等含硫、氨官能團發生反應來阻斷蛋白表達，以達到殺滅細菌作用。此外，鋅參與機體內多種酶的合成與激活，加速組織細胞生長發育及創傷后組織修復[13]，促進牙周膜細胞的增殖和分化[14]，在一定程度上具有保護牙體組織和抗菌、促愈的雙重功效。在米諾環素、鋅之外，我們采用生物可降解聚合物納米材料作為載體，其具有良好的生物相容性，能夠高效富集到靶組織，使裝載藥物最大限度發揮靶向治療作用，并且可在體內降解，不會對人體造成損害。

清除細菌是治療牙周炎最重要的手段。鹽酸米諾環素軟膏的有效成分是2%含量的鹽酸米諾環素，與我們自制米諾環素-鋅納米緩釋凝膠中米諾環素濃度相同。本研究結果顯示，治療后米諾環素凝膠組牙菌斑總菌數、牙齦卟啉單胞菌數均低于派力奧組和對照組，提示采用自制米諾環素-鋅納米緩釋凝膠治療的大鼠無論是牙菌斑總菌數還是牙齦卟啉單胞菌數均低于鹽酸米諾環素軟膏治療，表明米諾環素-鋅納米緩釋凝膠較鹽酸米諾環素軟膏有更好的抑菌效果；米諾環素凝膠組SBI、PLI低于派力奧組，提示米諾環素-鋅納米緩釋凝膠有較為肯定的抑菌作用；米諾環素凝膠組TM、ABL低于派力奧組，提示米諾環素凝膠治療后的牙齒松動度、牙槽骨喪失情況優于鹽酸米諾環素，表明米諾環素-鋅納米緩釋凝膠可以有效改善牙周炎的臨床體征。

綜上所述，米諾環素-鋅納米緩釋凝膠能夠有效治療大鼠實驗性牙周炎，可以抑制牙齦致病菌落生長、炎癥蛋白表達，減輕炎癥導致的牙齦出血、牙齦松動等臨床癥狀，具有臨床應用價值。

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