不同濃度乙酰膽堿對骨骼肌干細胞增殖、分化的影響

向力，陳紹娟，江淼，袁也，鄭飛，王露，張蕾，唐俊明,4(1湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北十堰 44000；湖北醫藥學院附屬人民醫院；3十堰市太和醫院；4胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室)

骨骼肌萎縮是一種常見的生理和病理過程，其機制非常復雜[1]。隨著年齡的增長或在病理條件下，骨骼肌會發生損耗和萎縮，骨骼肌干細胞則能以增殖、分化的方式來實現骨骼肌的自我更新和修復[2,3]。近年研究發現，肌肉萎縮可能與交感神經過度興奮有關[4～6]。交感舒血管神經興奮時，發揮生物學效應的主要神經遞質是乙酰膽堿。但乙酰膽堿是否參與了骨骼肌干細胞增殖、分化過程，從而影響骨骼肌的自我更新或修復，尚不明確。2016年6月～2017年8月，我們采用連續單次給予乙酰膽堿模擬交感神經興奮后效應，觀察乙酰膽堿對骨骼肌干細胞增殖、分化的影響，探討乙酰膽堿是否通過影響骨骼肌自我更新或修復而參與骨骼肌萎縮過程。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 小鼠骨骼肌干細胞C2C12細胞系購自中科院上海細胞庫。乙酰膽堿購自美國Sigma公司；TRIzol總RNA提取試劑購自Invitrogen公司；DNA反轉錄試劑盒、BCA蛋白質濃度測定試劑盒購自Thermo公司；配對盒基因7(Pax7)、生肌調節因子(MyoD)、肌細胞生成蛋白(MyoG)、生肌調節因子(MYf5)、GAPDH引物均由南京金斯瑞公司合成；肌球蛋白重鏈(MYH)(H-300)兔多克隆抗體，MyoG小鼠多克隆抗體，毒蕈堿樣乙酰膽堿受體亞型M1、M2、M3山羊多克隆抗體，M4、M5兔多克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗羊二抗，HRP標記的抗小鼠二抗均購自Santa Cruz公司；HRP標記的抗兔二抗，一抗、二抗稀釋液、封閉液均購自碧云天生物技術研究所；聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus發光試劑均購自Millipore公司。

1.2 C2C12細胞的培養、誘導分化 將凍存的C2C12細胞常規復蘇，接種于75 cm2的培養皿中，培養條件為10%胎牛血清+高糖DMEM培養基即為增殖培養基，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。待細胞增殖融合達80%～90%時，按照1∶3的比例傳代。傳代的C2C12細胞按上述條件繼續培養。當細胞融合達到80%時，換用含有2%馬血清(HS)的DMEM分化培養基(DM)進行成肌誘導分化，當細胞分化5 d后，在光學顯微鏡下觀察見已經形成典型的肌管，采用免疫熒光法檢測成肌細胞分化標志物MYH、MyoG的表達均呈強陽性，表明成肌細胞培養成功。

1.3 C2C12細胞毒蕈堿樣乙酰膽堿受體亞型表達檢測 ①實時定量PCR法。收集C2C12細胞，按TRIzol法分別提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，行分光光度計檢測RNA濃度，并逆轉錄為cDNA，按SYBR?PremixExⅡ法行實時定量PCR反應，檢測毒蕈堿樣乙酰膽堿受體M1～M5亞型表達。引物序列：M1受體上游5′-CCTGAG-CTACCGAGCCAAG，下游 5′-CCCAACTAGGTATTGCCAGAAG-3′；M2受體上游5′-GGGACCTGTAGTGTGCGAC-3′，下游5′-GGGTAGGTTAGAGGTTTTGT-GAC-3′；M3受體上游5′-CCTCGCCTTTGTTTCCCAA-C，下游5′-TTGAGGAGAAATTCCCAGAGGT-3′；M4受體上游5′-ATGGCGAACTTCACACCTGTC-3′，下游 5′-CTGTCGCAATGAACACCATCT-3′；M5受體上游5′-TCAACGGCACCCCAGTAAATC-3′，下游5′-GGATGTAGGTCGTGTAGAGGTTC-3′；GAPDH上游5′-ATGACTCCACTCACGGCAAA-3′，下游5′-ATGATGACCCTTTTGGCTCC-3′。以GADPH為內參，使用公式2-ΔΔCt計算mRNA的差異倍數。②Western blotting法。取C2C12細胞，經RIPA裂解、離心收蛋白，行BCA法進行蛋白定量。按分組各上樣50 μg 蛋白，經10%SDS-PAGE電泳后，轉PVDF膜。用TBST配制的5%的脫脂奶粉低速搖床封閉40 min，分別放入含有α-Tubulin 、M1～M5受體等不同一抗的封閉袋中，4 ℃過夜，將條帶放入含有辣根過氧化酶標記的二抗(1∶10 000)孵育液中2 h。最后用化學發光法顯色，在BioRad蛋白成像儀成像，用Image J軟件測灰度值進行半定量分析。

1.4 乙酰膽堿對C2C12細胞增殖的影響觀察

1.4.1 細胞分組及干預方法 C2C12細胞傳代后，在增殖培養基中培養至50%融合時，分為對照組、乙酰膽堿1組、乙酰膽堿2組、乙酰膽堿3組、乙酰膽堿4組，分別加入乙酰膽堿0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，每隔1日換液1次，培養72 h。

1.4.2 細胞增殖情況檢測 采用CCK8法。取各組細胞，于37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK8，孵育2 h。在全自動酶標儀上檢測450 nm光密度值(OD值)，評價C2C12細胞增殖情況。

1.4.3 細胞增殖標志基因Pax7表達檢測 采用實時定量PCR法，進一步驗證乙酰膽堿是否影響C2C12細胞增殖。收集各組細胞，按TRIzol法提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，行分光光度計檢測RNA濃度，并逆轉錄為cDNA，按SYBR?PremixExⅡ法行實時定量PCR反應。引物序列：Pax7上游引物5′-TCTCCAAGATTCTG-TGCCGAT-3′，下游5′-CGGGGTTCTCTCTCTTATACT-CC-3′；GAPDH上游5′-ATGACTCCACTCACGGCAA-A-3′，下游5′-ATGATGACCCTTTTGGCTCC-3′。以GADPH為內參，使用公式2-ΔΔCt計算mRNA的差異倍數。

1.5 乙酰膽堿對C2C12細胞分化的影響觀察

1.5.1 細胞分組及干預方法 取用2%HS誘導分化1 d后的C2C12細胞，分為對照2組、乙酰膽堿5組、乙酰膽堿6組、乙酰膽堿7組、乙酰膽堿8組，分別加入乙酰膽堿0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，每隔1日換液1次，培養5 d。

1.5.2 細胞分化情況檢測 采用光學顯微鏡觀察法。取各組細胞，在光學顯微鏡下觀察各組肌管的形成情況。

1.5.3 細胞分化相關基因mRNA表達檢測 采用實時定量PCR法。取各組細胞，TRIzol法提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，行分光光度計檢測RNA濃度，并逆轉錄為cDNA，按SYBR?PremixExⅡ法行實時定量PCR反應。引物序列：MyoD上游5′-CCACTCCGGGACATAGACTTG-3′，下游5′-AAAAGCGCAGGTCTGGTGAG-3′；MyoG上游5′-GAGACATCCCCCTATTTCTACCA-3′，下游5′-GCTCAGTCCGCTCATAGCC-3′；Myf5上游5′-GCCTTCGGAGCACACAAAG-3′，下游5′-TGACCTTC-TTCAGGCGTCTAC-3′；GAPDH上游5′-ATGACTCCA-CTCACGGCAAA-3′，下游5′-ATGATGACCCTTTTGGCTCC-3′。以小鼠GADPH為內參，使用公式2-ΔΔCt計算mRNA的差異倍數。

2 結果

2.1 乙酰膽堿M1～M5受體表達比較 M2受體mRNA及蛋白表達均為最高，M3受體mRNA及蛋白表達均為最低(P均<0.05)。見表1。

表1 C2C12細胞乙酰膽堿M1～M5受體表達比較

注：與其他受體 mRNA表達比較，*P<0.05。

2.2 各組細胞增殖情況比較 與對照組比較，乙酰膽堿1～4組各時點細胞增殖差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

2.3 各組細胞增殖標志基因Pax7表達比較 與對照組比較，乙酰膽堿1～4組Pax7 mRNA 表達差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組細胞增殖及Pax7 mRNA 表達比較

2.4 各組細胞分化情況 光鏡下發現，與對照2組相比，乙酰膽堿5組C2C12細胞分化明顯，且肌管數目略有增多；乙酰膽堿6～8組C2C12細胞分化呈現減弱趨勢，成熟肌管數目減少、分化被抑制，以乙酰膽堿8組分化為成熟肌管數目減少最明顯。

2.5 各組細胞分化相關基因表達比較 乙酰膽堿5、6組MyoG mRNA表達均高于對照2組(P均<0.05)。乙酰膽堿7、8組MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表達均低于對照2組，且乙酰膽堿8組MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表達均低于乙酰膽堿7組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表達比較

注：與對照2組比較，*P<0.05；與其他乙酰膽堿組比較，#P<0.05。

3 討論

骨骼肌由具有收縮能力的肌細胞組成，約占全身重量的40%，身體的幾乎任何活動都是依靠骨骼肌的收縮來完成，骨骼肌的狀況直接影響人體的力量和耐力。既往研究認為，肌肉的萎縮與失神經、營養不良、廢用以及惡病質有關[7]。在臨床實踐中發現，心力衰竭、糖尿病患者常伴有交感神經過度興奮的特征，與此同時伴有骨骼肌萎縮的癥狀。而骨骼肌的萎縮又進一步惡化心力衰竭患者的運動康復、糖尿病患者骨骼肌對胰島素的抵抗[8,9]。研究顯示，心力衰竭時交感神經過度興奮將引起骨骼肌的萎縮[9,10]。上述變化均顯示一個共同的特征，即交感神經過度興奮與骨骼肌萎縮有關。但實際上，骨骼肌本身除了受運動神經支配外，骨骼肌血管還受交感舒血管神經支配，其共性是末梢釋放的均是乙酰膽堿，但乙酰膽堿在骨骼肌自我更新及損傷修復中的作用及其導致骨骼肌萎縮的機制至今不明。

既往研究更多的乙酰膽堿M1～M5受體在心肌細胞和平滑肌細胞中的作用，而乙酰膽堿M受體在干細胞中的作用僅見零星報道，如發現乙酰膽堿M3受體具有促進干細胞增殖的作用[11,12]，而M2受體具有抑制干細胞增殖而促進干細胞分化的作用[13,14]。既往研究顯示，增加的cGMP或降低的cAMP有利于干細胞向心肌細胞分化[15]。本研究發現，C2C12細胞M2受體mRNA及蛋白表達均為最高，乙酰膽堿5組C2C12細胞分化明顯、有肌管形成，提示較低劑量的乙酰膽堿可促進骨骼肌干細胞的分化；C2C12細胞M3受體mRNA及蛋白表達均為最低，且與對照組比較，乙酰膽堿1～4組各時點細胞增殖及Pax7 mRNA 表達差異均無統計學意義，提示乙酰膽堿對C2C12細胞增殖活性沒有明顯影響，表明乙酰膽堿沒有影響C2C12細胞的增殖活性,可能與M3受體表達水平較低有關。以上結果表明，乙酰膽堿對C2C12細胞的增殖及分化的影響與其M2受體、M3受體有關。

胚胎期特異性的骨骼肌分化主要通過特異性骨骼肌轉錄因子決定的。其中，MyoD基因家族控制著肌細胞的增殖和分化，與肌纖維的數量、大小有著密切的關系[14]。MyoD基因家族可編碼多種不同的轉錄因子如MyoD、MyoG、Myf5、MRF4等，它們各自或協同控制著骨骼肌生成方面的關鍵調節因子。而出生后，肌肉的使用程度與特異性的神經支配決定了肌肉收縮性蛋白的組成和更新程度[14,15]。MyoD不僅可使靜止期的肌衛星細胞向成肌細胞，而且能把多種類型的細胞轉化為成肌細胞，并促使成肌細胞融合、分化為成熟的肌纖維。本課題組前期研究發現，交感神經長期過度興奮時，表現出抑制骨骼肌衛星細胞分化形成肌小管的能力[6]。本研究發現，乙酰膽堿5、6組MyoG mRNA表達均高于對照2組，提示低濃度的乙酰膽堿更可能主要通過影響MyoG的表達而促進成肌細胞向肌小管分化形成，這與本研究觀察到的乙酰膽堿5組細胞分化明顯、肌管數目略有增多相吻合。

但在交感舒血管神經興奮時，乙酰膽堿大量釋放所導致的乙酰膽堿濃度升高狀態對于骨骼肌干細胞的影響，是否與低濃度乙酰膽堿促進分化的作用效果相同尚不明確。Myf5或MyoD均敲除的小鼠既不能生成骨骼肌，也無成肌細胞群[15]。而MyoG敲除的胚胎鼠具有幾乎正常數目的衛星細胞和成肌細胞，但不能向肌細胞分化;提示MyoG位于MyoD或Myf5的下游，在成肌細胞向肌小管分化形成的過程中具有獨特的功能。既往研究發現，MyoD可結合MyoG等基因啟動區發揮其調節作用，促進它們的轉錄激活[15]。本研究發現，乙酰膽堿7、8組MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表達均低于對照2組，且乙酰膽堿8組MyoG、MyoD、Myf5 mRNA表達均低于乙酰膽堿7組，結合乙酰膽堿6～8組C2C12細胞分化呈現減弱趨勢、以乙酰膽堿8組分化為成熟肌管數目減少最明顯的結果，考慮高濃度的乙酰膽堿具有強烈的抑制C2C12細胞分化的作用;表明乙酰膽堿大量釋放時可明顯抑制C2C12細胞的分化，可能與抑制細胞分化相關基因MyoG、MyoD、Myf5的表達有關。可見，交感舒血管神經異常過度興奮時，其過多釋放的乙酰膽堿可抑制骨骼肌干細胞分化，而引起骨骼肌損傷或更新不足，可能是導致骨骼肌萎縮的機制之一。

綜上所述，高濃度乙酰膽堿可抑制C2C12細胞分化及其肌管形成，其機制可能與抑制分化相關基因MyoG、MyoD、Myf5的表達有關，可能是交感舒血管神經興奮釋放大量乙酰膽堿后導致骨骼肌萎縮的內在機制之一。

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