Rab11對膀胱癌細胞順鉑化療耐藥性的影響及機制

宮雪，于柳，劉嘉，劉屹立，王平(中國醫科大學附屬第四醫院，沈陽003；中國醫科大學)

膀胱癌是泌尿生殖系統中最常見的惡性腫瘤，其發病率逐年升高[1,2]。約25%的初診患者被診斷為肌層浸潤性膀胱癌，其中約30%的患者存在遠處轉移[3]。順鉑是一種細胞毒性化療藥物，為膀胱癌治療的一線用藥，但總體預后較差[4]。化療藥物的重復給藥可能造成腫瘤細胞的獲得性藥物抵抗，臨床上約有40%的膀胱癌患者在5年內由于化療抵抗引起腫瘤的復發[5]。因此，增強膀胱癌細胞對順鉑的敏感性是提高順鉑療效的重要手段。小鳥苷三磷酸(GTP)酶是Rab小分子GTP酶家族成員之一，在囊泡內吞再循環過程中發揮重要作用[6,7]。近年研究發現，Rab11參與了惡性腫瘤的多項生物學進程，與結直腸癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌等惡性腫瘤的發生發展密切相關[8～13]。Rab11能夠促進膀胱癌細胞的增殖和侵襲能力，但其在腫瘤細胞順鉑耐藥中的作用尚不明確。2015年12月～2016年 1月，我們觀察了雙向調控Rab11對順鉑干預后膀胱癌細胞凋亡及對凋亡相關蛋白B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)蛋白的影響，探討Rab11在膀胱癌細胞順鉑化療耐藥性中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌細胞系T24、BIU-87細胞購于美國模式培養物保藏中心(ATCC，Manassas，USA)；Rab11(Proteintech，USA)；Bcl-2(Cell Signaling，USA)；β-actin(Santa Cruz，USA)；Rab11 ONTARGETplus siRNA、陰性對照NonTargeting siRNA(Dharmacon，USA)；pCMV6-Rab11質粒、陰性對照pCMV6質粒(Origene，USA)；RPMI-1640培養基(Gibco，USA)；10%胎牛血清(Invitrogen，USA)；DMSO(Sigma，USA)；ECL試劑盒(Pierce，USA)；PVDF膜(Millipore，USA)；DNR 成像系統(Jerusalem，Israel)。

1.2 細胞培養、分組及順鉑干預方法 將T24、BIU-87細胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養，隔天換液。 取對數生長期的T24、BIU-87細胞懸液，按1×106/孔分別接種于6孔板；將T24細胞分為觀察1組、對照1組，將BIU-87細胞分為觀察2組、對照2組，分別加入2 μmol/L順鉑誘導凋亡，24 h后進行轉染。

1.3 轉染方法 在T24細胞中轉染Rab11特異性siRNA，在BIU-87細胞中轉染Rab11過表達質粒，并設立陰性對照。轉染步驟及劑量參照說明書。采用Western blotting法檢測細胞Rab11蛋白的相對表達量，以T24細胞轉染后Rab11表達量降低、BIU-87細胞轉染后Rab11表達量升高為轉染成功。觀察1組細胞轉染Rab11特異性siRNA，對照1組細胞轉染Control siRNA，觀察2組細胞轉染Rab11過表達質粒，對照2組細胞轉染pCMV6質粒。

1.4 細胞存活率測算 采用CCK-8法。轉染48 h后收集各組細胞，將單個細胞懸液按1×103/孔接種于96孔培養板，每孔體積200 L。培養24 h后，每孔加入10 μL CCK-8繼續培養4 h，吸去上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，于490 nm波長處測定各孔吸光度值。以不含細胞的等體積培養基作為對照，繪制細胞生長曲線，計算細胞存活率。

1.5 細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。轉染48 h后收集各組細胞。取5×105～10×105重懸的細胞，離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC混勻，4 ℃避光孵育15 min。加入5 μL碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，4 ℃避光孵育5 min。隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC 為綠色熒光，對應BD 流式細胞儀FL1檢測通道；碘化丙啶(PI)為紅色熒光，對應BD 流式細胞儀FL2檢測通道。計算細胞凋亡率。

1.6 細胞Bcl-2蛋白表達檢測 采用Western blotting法。轉染48 h后收集各組細胞，加入Pierce裂解緩沖液提取總蛋白，目標蛋白定量參照BCA方法，上樣量為20 g，電泳，轉膜，孵育一抗Bcl-2(1∶1 000)，4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育2 h，ECL發光。通過凝膠分析系統掃描目的條帶和內參的灰度比，作為Bcl-2蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞存活率比較 觀察1組細胞存活率低于對照1組，觀察2組細胞存活率高于對照2組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組細胞凋亡率比較 觀察1組細胞凋亡率高于對照1組，觀察2組細胞凋亡率低于對照2組(P均<0.05)。見表1。

2.3 各組細胞Bcl-2蛋白表達比較 觀察1組細胞Bcl-2蛋白表達低于對照1組，觀察2組細胞Bcl-2蛋白表達高于對照2組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞存活率、凋亡率及Bcl-2蛋白表達比較

注：與對照組1比較，*P<0.05；與對照組2比較，﹟P<0.05。

3 討論

膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最常見的類型，其發病率逐年升高，是泌尿生殖系統中致死性最強的惡性腫瘤。順鉑是一種細胞毒性化療藥物，其抗腫瘤機制主要是引起腫瘤細胞DNA損傷，進而促進腫瘤細胞凋亡[14～16]。以順鉑為基礎的化療方案對晚期膀胱癌患者具有十分重要的治療作用，但其總體預后較差，順鉑耐藥是其中最重要的原因。因此，探討增強膀胱癌細胞對順鉑的敏感性、逆轉耐藥性方法，對晚期膀胱癌的治療具有非常重要的臨床意義。

Rab蛋白是囊泡內吞過程中的一個重要因素。 Rab11蛋白是小GTP酶，并調節蛋白質運輸，囊泡運輸，參與細胞遷移和腫瘤形成等生物學行為，Rab11的高表達能促進多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移。Chung等[8]研究發現，Rab11的高表達可通過增加E-鈣黏蛋白的表達量來促進集合細胞的遷移，并與結直腸癌的不良預后有關。Rab11相互作用蛋白2在結直腸癌組織中表達上調，可調節基質金屬蛋白酶7的表達，促進結直腸癌細胞的侵襲和遷移[9]。Rab11相互作用蛋白2的高表達與胃癌組織中的淋巴結轉移相關[10]。Rab11相互作用蛋白3與再循環內體有關，并通過調節肌動蛋白細胞骨架來調節乳腺癌細胞運動[11]。Rab11相互作用蛋白4的高表達可以預測胰腺癌患者的不良預后，并與腫瘤進展有關[12]。這些研究表明，Rab11可能是人類腫瘤中潛在的癌蛋白，參與腫瘤形成、腫瘤進展。本課題組前期研究發現，Rab11在膀胱癌組織中高表達，其機制為通過NF-κB信號通路促進膀胱癌細胞的增殖和侵襲。本研究進一步探討Rab11在膀胱癌細胞順鉑化療耐藥性中的作用和機制。本研究發現，觀察1組細胞存活率低于對照1組，觀察2組細胞存活率高于對照2組;提示抑制Rab11表達可以減少膀胱癌細胞的存活率，而過表達Rab11可以增加膀胱癌細胞的存活率；觀察1組細胞凋亡率高于對照1組。觀察2組細胞凋亡率低于對照2組；提示抑制Rab11表達可以增加膀胱癌細胞的凋亡率，過表達Rab11可以降低膀胱癌細胞的凋亡率。本研究結果表明，Rab11能明顯減少順鉑誘導的膀胱癌細胞凋亡、增加腫瘤細胞存活率，增強膀胱癌細胞對化療藥物順鉑的耐藥性。

Bcl-2基因是重要的凋亡抑制基因，可以抑制內膜鈣離子的釋放；具有抗氧化的作用或抑制氧自由基的產生；阻止胞內細胞色素C的釋放；通過抑制白介素-1β轉化酶(ICE)的自身催化而抑制凋亡。Bcl-2和NF-κB的表達有相關性，Bcl-2大多數與NF-κB同時表達。NF-κB通過上調Bcl-2基因表達，抑制腫瘤細胞凋亡。Tamatani等[17]發現，在神經元低氧/氧再灌注處理中，NF-κB的活化誘導Bcl-2過度表達，阻止低氧/氧再灌注后凋亡細胞增多。本研究發現，觀察1組細胞Bcl-2蛋白表達低于對照1組，觀察2組細胞Bcl-2蛋白表達高于對照2組，提示抑制Rab11可顯著減少凋亡抑制因子Bcl-2的表達，而過表達Rab11可明顯增加Bcl-2蛋白的表達，表明Rab11能夠通過調節凋亡相關蛋白Bcl-2的表達來影響膀胱癌細胞的凋亡。

綜上所述，Rab11過表達能明顯減少順鉑誘導的膀胱癌細胞凋亡率、增加細胞存活率，表明Rab11可增強膀胱癌細胞對化療藥物順鉑的耐藥性。本研究為膀胱癌的靶向治療提供了實驗基礎。

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[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2012, 62(1):10-29.

[2] Liang PY, Li HY, Zhou ZY, et al. Overexpression of immunoglobulin G prompts cell proliferation and inhibits cell apoptosis in human urothelial carcinoma[J]. Tumor Biol, 2013, 34(3):1783-1791.

[3] Kamat AM, Hahn NM, Efstathiou JA, et al. Bladder cancer[J]. Lancet, 2016, 388(10061):2796-2810.

[4] Vaishampayan U. Systemic therapy of advanced urothelial cancer[J]. Curr Treat Options Oncol, 2009, 10(3-4):256-266.

[5] Sun Y, Guan Z, XuY, et al. HIF-1α/MDR1 pathsway confers chemoresistance to cisplatin in bladder cancer[J]. Oncol Rep, 2016, 35(3):1549-1556.

[6] Kim CM, Choi JY, Yoon JH, et al. Purification, crystallization and X-ray crystallographic analysis of human RAB11 (S20V), a constitutively active GTP-binding form[J]. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun, 2015, 71(10):1247-1250.

[7] Fujita A, Koinuma S, Yasuda S, et al. GTP hydrolysis of TC10 promotes neurite outgrowth through exocytic fusion of Rab11- and L1-containing vesicles by releasing exocyst component Exo70[J]. PLoS One, 2013, 8(11):e79689.

[8] Chung YC, Wei WC, Hung CN, et al. Rab11 collaborates E-cadherin to promote collective cell migration and indicates a poor prognosis in colorectal carcinoma[J]. Eur J Clin Invest, 2016, 46(12):1002-1011.

[9] Xu CL, Wang JZ, Xia XP, et al. Rab11-FIP2 promotes colorectal cancer migration and invasion by regulating PI3K/AKT/MMP7 signaling pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 470(2):397-404.

[10] Dong W, Qin G, Shen R. Rab11-FIP2 promotes the metastasis of gastric cancer cells[J]. Int J Cancer, 2016, 138(7):1680-1688.

[11] Jing J, Tarbutton E, Wilson G, et al. Rab11-FIP3 is a Rab11-binding protein that regulates breast cancer cell motility by modulating the actin cytoskeleton[J]. Eur J Cell Biol, 2009, 88(6):325-341.

[12] He Y, Ye M, Zhou L, et al. High Rab11-FIP4 expression predicts poor prognosis and exhibits tumor promotion in pancreatic cancer[J]. Int J Oncol, 2017, 50(2):396-404.

[13] Gebhardt C, Breitenbach U, Richter KH, et al. c-Fos-dependent induction of the small ras-related GTPase Rab11a in skin carcinogenesis[J]. Am J Pathol, 2005, 167(1):243-253.

[14] Vitale I, Galluzzi L, Castedo M, et al. Mitotic catastrophe: a mechanism for avoiding genomic instability[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2011,12(6):385-392.

[15] Galluzzi L, Vitale I, Abrams JM, et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012[J]. Cell Death Differ, 2012, 19(1):107-120.

[16] Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden BT, et al. Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2010,11(10):700-714.

[17] Tamatani M, Mitsuda N, Matsuzaki H, et al. A pathway of neuronal apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation: roles of nuclear factor-kappaB and Bcl-2[J]. J Neurochem, 2000,75(2):683-693.