雷公藤多苷對糖尿病大鼠肝臟損傷的影響及機制

白鈺，劉應生，馬曉麗(新疆醫科大學附屬中醫醫院，烏魯木齊830000；新疆醫科大學)

糖尿病是一種常見的內分泌疾病，主要是指胰島素分泌或作用存在缺陷而引起的以慢性(長期)高血糖為主要特征的代謝異常綜合征，常見于中老年人[1,2]。糖尿病可引起多種慢性并發癥，可涉及肝、腎、肺、骨骼肌、神經系統、視網膜、血管及皮膚等組織器官，嚴重影響患者的生活質量[3,4]。糖尿病肝臟病變相對輕微、隱匿，臨床上常常會忽視，但其卻是引起慢性肝病和肝臟酶譜異常的主要原因，且缺乏有效的治療手段。因而，尋找新的治療策略對于提高糖尿病肝臟損傷的防治水平至關重要[5,6]。雷公藤多苷是從雷公藤系衛矛科植物中提取的活性成分，具有良好的抗炎和免疫抑制作用，能延緩糖尿病腎病進展，但其對糖尿病肝病的效果仍需作進一步的深入研究[7,8]。2017年1月～10月，我們對糖尿病大鼠模型給予雷公藤多苷進行干預，探討雷公藤多苷對糖尿病大鼠肝損傷的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取SPF級健康、雄性Wistar大鼠60只，體質量170～210 g，購于新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心。采用隨機數字表法隨機選取12只大鼠作為對照組，其余48只建立糖尿病大鼠模型，成模大鼠隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組12只。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型建立 參照文獻[9]中的方法將模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠制備糖尿病模型，具體方法如下：大鼠均腹腔注射含65 mg/kg鏈尿佐菌素(STZ)的檸檬酸鈉緩沖液，注射3 d后采尾部靜脈血測血糖，當血糖濃度達到16.7～22.2 mmol/L即為造模成功。對照組大鼠注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。兩組大鼠飼養條件完全相同，每日觀察各組大鼠的一般情況，并記錄各組大鼠的體質量和血糖水平。

1.2.2 干預方法 造模成功后，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予1、3、6 mg/(kg·d)雷公藤多苷灌胃，對照組和模型組給予同等體積的蒸餾水進行灌胃。連續給藥8周，干預期間不給予任何降糖治療。

1.2.3 血清NF-κB和TNF-α水平檢測 采用ELISA法。干預 8周后取動脈血，以3 500 r/min離心10 min，取上清液，采用酶聯免疫吸附法測定血清NF-κB和TNF-α水平。各檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 肝組織形態觀察 各組大鼠取血后處死，取出肝臟，以冰PBS反復灌注沖洗后用濾紙吸去多余水分。取部分肝組織以10%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋后做連續切片；行HE和Masson染色，顯微鏡下大鼠肝臟組織形態學變化。

1.2.5 肝組織Toll樣受體4(TLR4)、NF-κB mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取部分肝組織，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，利用逆轉錄試劑盒逆轉錄為DNA，在聚合酶的作用下進行擴增。RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒以及RT-PCR試劑盒均購自美國Thermo公司。TLR4上游引物5′-GTTCATCTGCTTTCTGCTG-3′，下游引物5′-TGATTCTGCCTGATGTTGC-3′；NF-κB上游引物5′-AAAAACG-CATCCCAAGGTGC-3′，下游引物5′-AAGCTCAAGCCACCATACCC-3′。擴增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，72 ℃ 330 s，共進行40個循環。電泳后得到目的條帶的光密度值，然后與對照組的光密度值進行比較，最終得出TLR4、NF-κB mRNA的表達水平，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。以目標mRNA灰度值/β-actin灰度值表示。

1.2.6 肝組織TLR4、NF-κB蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取大鼠肝組織制備蛋白樣，并取約75 μg以10%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。TLR4小鼠單克隆抗體、NF-κB p65兔多克隆抗體均購自英國Abcam公司。電泳分離后轉移至孔徑為0.45 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，置于5%脫脂奶粉中封閉2 h；加入一抗(TLR4、NF-κB)后4 ℃孵育過夜，以0.5%TBS-T溶液洗膜3次后再加入HRP標記的二抗進行反應;以0.5%TBS-T溶液洗膜3次用化學發光法進行顯色，并采用軟件進行灰度值分析，計算各目標蛋白與β-actin的灰度比值。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟形態觀察 HE染色顯示,對照組大鼠肝小葉結構清晰，肝索排列規則，肝細胞繞中央靜脈呈放射狀排列，細胞大小均勻，胞核呈圓形；模型組肝小葉結構消失，肝細胞形態不規則，細胞腫脹呈彌漫性大泡樣脂肪變性；低劑量組、中劑量和高劑量組肝損傷較模型組有不同程度減輕，其中高劑量組改善最為明顯。見圖1。Masson染色顯示，與對照組比較，模型組肝組織可見大量粗大藍色膠原纖維，而低劑量組、中劑量和高劑量組藍色膠原纖維均有所減少，其中高劑量組僅見少量藍色纖維。見圖2。

注：A為對照組；B為模型組；C為低劑量組；D為中劑量組；E為高劑量組。圖1 各組肝組織形態表現(HE染色，×40)

注：A為對照組；B為模型組；C為低劑量組；D為中劑量組；E為高劑量組。圖2 各組肝組織形態表現(Masson染色，×40)

2.2 各組血清NF-κB、TNF-α水平比較 模型組血清NF-κB和TNF-α水平均高于對照組(P均<0.05)。低劑量組、中劑量組和高劑量組血清NF-κB和TNF-α水平均低于模型組(P均<0.05)。中劑量組和高劑量組血清NF-κB和TNF-α水平均低于低劑量組，高劑量組血清NF-κB和TNF-α水平均低于中劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血清NF-κB及TNF-α水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，﹟P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

2.3 各組肝組織TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白表達比較 模型組TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白表達均高于對照組(P均<0.05)。低劑量組、中劑量組和高劑量組TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達均低于模型組(P均<0.05)。中劑量組和高劑量組TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達均低于低劑量組，高劑量組TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達均低于中劑量組(P均<0.05)。見表2、圖3。

3 討論

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，主要是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起，其發病率較高，現已成為危害人類健康的主要疾病之一[10]。糖尿病可引起多種慢性疾病的發生，其不但可引起腎臟、心臟、視網膜、神經等組織器官的損害，亦可導致各種類型的肝臟損傷[11]。研究表明，糖尿病患者可發生非特異性肝酶學異常，其微血管病變及微循環障礙可累及機體各臟器缺血缺氧，而缺血可引起肝細胞內二氧化碳蓄積、酸中毒、氧供減少、氧消耗增加，使肝臟轉氨酶活性增加，膽紅素代謝紊亂，重者可引起肝細胞壞死，尤其是當合并糖尿病酮癥酸中毒時更易發生肝臟損害[12]。糖尿病與脂肪肝的關系也較為密切，在引起脂肪肝的所有病因中，糖尿病占第三位，僅次于肥胖與飲酒。另外，糖尿病患者易患病毒性肝炎，其患病率約為正常人的2～4倍，其原因可能是糖尿病患者對病毒的易感性增強，但目前對于糖尿病性肝臟損傷的發病機制仍不完全清楚，現有治療手段的效果也不甚理想。中藥雷公藤多苷是近些年研究的熱點之一，是一種新型的免疫抑制劑，主要是從雷公藤中提取分離而得。其具有較高的抗炎和免疫抑制活性，現已開始應用于類風濕關節炎的臨床治療[13]。也有研究表明，雷公藤多苷對于延緩糖尿病腎病的發展有一定的作用[14]。但對于其是否能治療糖尿病肝臟損傷，仍需作進一步的研究。

表2 各組大鼠肝組織TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，﹟P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

注：A為對照組；B為模型組；C為低劑量組；D為中劑量組；E為高劑量組。

圖3各組肝組織TLR-4、NF-κB蛋白表達情況(Westernblotting法)

糖尿病性肝損傷絕大部分表現為肝臟脂肪浸潤導致的非酒精性脂肪性肝病，這也是導致各種慢性肝病和肝臟酶譜異常的主要原因之一。本研究發現，模型組肝小葉結構消失，肝細胞形態不規則，細胞腫脹呈彌漫性大泡樣脂肪變性，提示糖尿病大鼠肝臟發生了一定程度的病理性改變。低劑量組、中劑量和高劑量組肝損傷有不同程度減輕，其中高劑量組改善最為明顯；提示雷公藤多苷對于糖尿病大鼠的肝臟損傷有一定的改善作用，且隨著雷公藤多苷的劑量增加，改善效果更加明顯。

TLR4是TLRs的亞型之一，在肝實質細胞和非實質細胞均廣泛表達，而TLR4信號通路是多種刺激因子的共同通路，可有效調控肝臟免疫、炎癥反應等相關基因的表達。NF-κB是TLR4信號通路中最關鍵的轉錄調控因子，在免疫和炎癥反應過程起著重要的作用。研究表明，NF-κB的激活可啟動或增強多種與炎癥、免疫相關的基因轉錄、翻譯，進而導致炎性介質大量釋放，并能引起粒細胞、巨噬細胞等殺傷細胞的趨化和聚集，炎性細胞浸潤，與肝臟損傷有著密切的關系。本研究發現，模型組TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白表達均高于對照組，提示TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白表達可能與肝臟損傷有著密切的關系；而高劑量組TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白相對表達量較模型組、低劑量組和中劑量組降低，提示雷公藤多苷可有效抑制TLR-4、NF-κB mRNA和蛋白的表達，進而抑制TLR4/NF-κB信號通道的介導作用，且隨著劑量的加大，抑制作用更加明顯，而這可能是雷公藤多苷能改善糖尿病患者肝損傷的機制之一。

進一步分析發現， 模型組血清NF-κB和TNF-α水平均高于對照組，提示大鼠血清 NF-κB和TNF-α水平可能與肝臟損傷有著密切的關系；而低劑量組、中劑量組和高劑量組血清NF-κB和TNF-α水平均低于模型組，且高劑量組血清NF-κB和TNF-α水平均低于中劑量組及低劑量組，提示雷公藤多苷可有效抑制各種炎癥因子的表達水平，進而改善肝損傷程度，且隨著劑量的加大，抑制效果更為明顯，其機制可能與雷公藤多苷能抑制TLR-4信號通道的介導有關。

綜上所述，雷公藤多苷可減輕糖尿病大鼠的肝臟損傷，其機制可能與抑制TLR-4/NF-κB介導的炎癥信號通路有關，值得進一步研究。

：

[1] Group IHS. Minimizing hypoglycemia in diabetes[J]. Diabetes Care, 2015, 38(8):1583.

[2] Benjamin FV, Laura JS, Valgerdur S, et al. Twelve type 2 diabetes susceptibility loci identified through large-scale association analysis[J]. Nat Rev Genet, 2015, 42(7):579-589.

[3] 楊立勇.關注糖尿病微血管并發癥研究進展[J].中國糖尿病雜志,2016,8(8):449-451.

[4] 朱秋榮,徐惠慶,駱田斌,等.2型糖尿病患者慢性并發癥與腦卒中發病的關系[J].浙江預防醫學,2017,29(4):351-354.

[5] 袁敏,張敏,楊長青.肝硬化患者糖代謝異常與肝功能關系的臨床回顧性分析[J].國際消化病雜志,2015,35(2):140-143.

[6] 陳育霞,劉樹紅,李明遠,等.糖尿病性肝纖維化伴肝微血管病變1例[J].肝臟,2015(8):656-657.

[7] 李穎,汪永忠,羅歡,等.類風濕關節炎患者雷公藤甲素血清濃度測定及其藥動學研究[J].中國中醫藥信息雜志,2014，21(1):85-87.

[8] 樊丹平,郭晴晴,鄭康,等.雷公藤甲素對膠原誘導關節炎大鼠MIP-1α、Eotaxin和MCP-1表達的影響[J].世界科學技術-中醫藥現代化,2016,18(6)：1027-1032.

[9] Nugent DA, Smith DM, Jones HB. A review of islet of Langerhans degeneration in rodent models of type 2 diabetes[J]. Toxicol Pathol, 2008,36(4): 529-551.

[10] Zinman B, Wanner C, Lachin JM, et al. Empagliflozin, cardiovascular outcomes, and mortality in type 2 diabetes[J]. N Engl J Med, 2015, 373(22):2117.

[11] Lurbe E, Redon J, Kesani A, et al. Increase in nocturnal blood pressure and progression to microalbuminuria in type 1 diabetes[J]. N Engl J Med, 2016, 348(3):260-264.

[12] 陳明云, 李婷婷, 張蓉,等. 成人隱匿性自身免疫性糖尿病合并非酒精性脂肪肝的臨床特征及其與血清C肽水平的關系[J]. 中華醫學雜志, 2015, 95(44):3575-3578.

[13] 周銘, 馬麗華, 崔穎,等. 雷公藤甲素對類風濕關節炎患者外周血T細胞的免疫抑制作用[J]. 中國藥房, 2014，25(47):4441-4443.

[14] 張敏, 王守安, 劉黎星. 雷公藤多苷干預TLR-NF-κB通路發揮免疫抑制作用[J]. 中草藥, 2014, 45(9):1288-1292.