柱前衍生-頂空氣相色譜法測定肉制品中亞硝酸鹽

王會波 劉盛田

亞硝酸鹽作為肉制品加工中的防腐劑和發色劑，可保持肉制品的色、香、味，同時對肉毒梭狀芽抱桿菌有抑制作用，具一定防腐性[1]，然而食品中殘留的亞硝酸鹽在一定條件下可與人體內仲胺、叔胺和氨基化合物反應形成強致癌物亞硝胺化合物，從而誘發消化系統癌變[2]。常用的亞硝酸鹽檢測方法有離子色譜法、分光光度法、熒光法、比色測定法、高效液相色法等[3-4]。本研究利用在酸性條件下亞硝酸鹽與環己基氨基磺酸鈉作用柱前衍生化生成易揮發的環己醇亞硝酸酯[5]，建立肉制品中亞硝酸鹽的頂空氣相色譜測定方法。該方法簡化了前處理步驟，方法簡便、線性范圍寬、檢測限低、適用范圍廣等特點，可用于肉制食品樣品的測定。

1 材料與方法

1.1儀器 氣相色譜儀(日本島津公司QP2010P，附FID檢測器)，頂空自動進樣系統(DANI HSS86.50型，意大利DANI公司)，Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)，DM-5毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，頂空瓶(20 mL，配帶有聚四氟膜的硅橡膠墊和鋁密封蓋)，頂空瓶瓶口密封器，研磨機(德國IKA公司)，恒溫水浴箱(北京長安科學儀器公司)，高速離心機(3k15型，德國SIGMA公司)。

1.2試劑 亞硝酸鹽標準溶液(100μg/mL，中國計量科學研究院)，硫酸(1%，優級純，國藥集團化學試劑有限公司)，環己基氨基磺酸鈉溶液(1%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)。

1.3方法原理 被測樣品溶液置于密封的頂空瓶中，在恒定的溫度和硫酸介質中，樣品中的亞硝酸鹽與環己基氨基磺酸鈉反應生成環己醇亞硝酸酯，環己醇亞硝酸酯在常溫下成氣態，取液上氣相樣品用帶有FID檢測器的氣相色譜儀進行分析，以保留時間定性，峰面積定量。

1.4儀器條件

1.4.1色譜條件： 程序升溫:初溫90 ℃，保留5 min，以15 ℃/min速率升至200 ℃，保留2 min；柱流量 1.5 mL/ min; 進樣口溫度：200 ℃； 進樣方式：分流進樣；分流比1∶5；檢測器溫度：250 ℃。

1.4.2頂空進樣器條件： 恒溫爐操作溫度：60 ℃；進樣系統操作溫度：100 ℃；傳輸管溫度：80 ℃；樣品加熱平衡時間：30 min；補壓時間:20 s；取樣時間：20 s；進樣時間：20 s。

1.5標準曲線制備 用1%硫酸溶液稀釋亞硝酸鹽標準溶液配制成0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0和50.0 μg/mL的工作溶液，然后吸取10.0 mL于頂空瓶中，配置成標準系列。

1.6樣品處理 用四分法取適量或取全部，用食物粉碎機絞碎攪勻。稱取試樣5 g(精確至0.01 g)，以80 mL 1%硫酸洗入100 mL容量瓶中，超聲提取30 min，每5 min振搖1次，保持固相完全分散。于 75 ℃水浴中放置 5 min，取出放置至室溫，加1%硫酸稀釋至刻度。溶液經濾紙過濾后，取部分溶液于10 000 r/min離心15 min,上清液備用。準確吸取10.0 mL上清液樣品置于頂空瓶中，加入200 μL 1%環己基氨基磺酸鈉溶液，迅速用壓蓋器將頂空瓶密封，渦旋混合，待分析。

2 結果

2.1氣相色譜條件的選擇 分別選用DM-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、RTX-624(30 m×0.32 mm×1.8 μm)、WAX(30 m×0.32 mm×0.25 μm)毛細管色譜柱進行分離比較，經試驗證明，DM-5柱為最好。環已醇亞硝酸酯的保留時間為2.934 min(圖1)。

圖1 環已醇亞硝酸酯分離色譜圖

2.2標準曲線及方法檢出限 配制亞硝酸鹽濃度依次為0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0和50.0μg/mL的標準系列，用外標法繪制出濃度-峰面積校正曲線。相關系數r=0.999 94，回歸方程Y=583.890X+100.263。本研究選用3倍信噪比為判斷標準，計算檢測量為0.2 μg，若取5 g樣品測定，測得亞硝酸鹽的最低檢出濃度0.040 mg/kg。當樣品含量較高時，可減少取樣量或者減少進樣量。

2.3方法的準確度和精密度實驗 取一根火腿腸為待測樣品，按照本方法進行頂空和色譜分離、測定，以保留時間定性，峰面積定量,測得本底值。同時在樣品分別加入高、中、低三個濃度的標準溶液后，做回收率試驗和精密度試驗(表1)。

表1 加標回收率和精密度試驗結果(n=6)

2.4本法與國標法比較 用本法與國標法(分光光度法)對10份不同市售肉制品樣品進行檢測，經過配對t檢驗，t=-0.5600.05，兩種方法差異無統計學意義(表2)。

表2 本方法與國標法測定亞硝酸鹽結果比較

3 討論

3.1通過對環己基氨基磺酸鈉濃度為1%時，分別加入100、200、300、400和500 μL進行測定，結果顯示當環己基氨基磺酸鈉加入量在200 μL以上時信號響應不再隨環己基氨基磺酸鈉的含量增加而升高，實驗時選擇200 μL。

3.2硫酸主要是給亞硝酸鹽酯化提供酸性環境，經實驗加入0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%硫酸時對檢測器的信號響應值沒有明顯影響，選擇使用1%硫酸。

3.3一般來說，平衡溫度越高，分析靈敏度越高，但過高的平衡溫度又會產生大量的水蒸氣，反而會降低響應值[6]。選擇在10 mL樣品中加入等量的標準溶液，在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃條件下平衡30 min，在同一色譜條件下分析。結果表明隨著溫度的升高，響應值一直在增大，但溫度過高，水量也在逐漸增大，會對檢測器有損害，因此在能滿足檢測限的要求下，選擇盡量低的保溫溫度，最終選擇60 ℃即可滿足要求。

3.4待測物質在氣液兩相達到平衡狀態需要一定的時間，選擇在10 mL樣品中加入等量的混合標準溶液，在60 ℃條件下設平衡時間為10、20、30、40和50 min，在同一色譜條件下分析。結果表明環己醇亞硝酸酯的峰面積隨著平衡時間的延長先增加然后趨于平緩，30 min后峰面積變化不明顯，故本方法先用30 min為平衡時間。

3.5頂空瓶中氣液兩相的體積比是影響靈敏度的一個參數。樣品液體取得太多，取頂空氣體的針會插入液面下，吸入樣品液體。樣品液體取得太少，靈敏度會很低。故選擇氣液體積比為1∶1，即取10 mL樣品進行分析較為合適。

4 小結

建立了柱前衍生-頂空氣相色譜法測定肉制品中亞硝酸鹽的方法，方法的檢出限、回收率和精密度均能滿足肉制品中亞硝酸鹽分析的要求。結果證明該方法操作簡便、快速、準確、可靠、靈敏度高，適用于肉制品中亞硝酸鹽的測定。雖只研究了肉制品中亞硝酸鹽檢測的適用性，還可利用本方法測試其他樣品中亞硝酸鹽的測定，如蔬菜、腌制食品、乳粉、葡萄酒、生活飲用水、尿液及血液等。

參考文獻

[1] 王志元,張思群,容慧.衍生化頂空氣相色譜法測定食品中的亞硝酸鹽[J].分析化學,1999,27(7):865.

[2] 柏林洋,宋金海,馮剛.亞硝酸鹽檢測方法的研究進展[J].廣州化工,2011,39(13):31-33.

[3] 徐玉蘭,何嬋,顧金梅.食品中亞硝酸鈉檢測方法的研究進展[J].中國調味品,2013,38(3):1-4,13.

[4] 徐珊珊,尤婷,范麗芳.生物樣品中亞硝酸鹽和硝酸鹽測定方法的研究概述[J].海峽藥學, 2008,20(3):77-78.

[5] 王叔淳.食品衛生檢驗技術手冊[M].北京:化學工業出版社，1994：207．

[6] 茍德國，黃忠平，陳京京，等.靜態頂空氣相色譜法測定地表水中苯系物[J].中國資源綜合利用，2011，29(3)：41-43.