基于SSR標記的55份清遠野生茶樹種質資源遺傳多樣性和親緣關系分析

穆小婷，廖偵成*，凌彩金，鄭溪，林建勇，何建平，江麗冰

1.清遠市農業科技推廣服務中心（清遠市農業科學研究所），廣東 清遠 511500；2.廣東省農業科學院茶葉研究所廣東省茶樹資源創新利用重點實驗室，廣東 廣州 510640

種質資源的研究和開發是茶葉產業發展的重要基礎。目前，茶樹種質資源研究主要集中在遺傳多樣性[1-2]、生化成分多樣性[3-5]、形態多樣性或表型多樣性[6-8]、根系土壤微生物群落多樣性[9-11]、抗性研究[12]等方面，遺傳多樣性分析主要從分子水平上對茶樹資源進行研究，包括SSR[13-14]、ISSR[15-17]、RAPD[18]、SRAP[19]、AFLP[20-21]、SRAP[22-23]、SNP[24]等分析方法。其中，SSR分子標記技術作為一種以特定引物的PCR 擴增為基礎發展起來的第二代分子標記技術，具有多態性高、重復性好、共顯性遺傳、操作簡單快速、數量豐富等優點，已廣泛應用于茶樹的遺傳多樣性分析和親緣關系分析[25-27]。

清遠市位于粵北山區，境內野生茶樹資源豐富，種類繁多，品質各異。通過對清遠本土野生茶樹資源的野外調查和資源采集，對清遠8 個縣（市、區）的55份代表性野生茶樹資源葉片樣品進行了SSR 位點多態性分析、群體遺傳多樣性分析和親緣關系分析，并對不同來源地的樣品進行了遺傳一致度和遺傳距離分析，綜合分析了清遠野生茶樹資源的遺傳多樣性和親緣關系情況，可為進一步開展本土茶樹種質資源的研究和開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

研究所用茶樹資源樣品來源于廣東省清遠市的清城區、清新區、英德市、連州市、佛岡縣、連山縣、連南縣、陽山縣等8 個縣（市、區），樣品共55份，對應編號見表1，資源均為當地本土繁殖的代表性野生茶樹，包括自然野生茶樹和本土茶樹種子繁殖的老茶樹，茶樹葉片有大葉、中葉和小葉等，葉片色澤以綠色和深綠色為主，部分葉片有紫色、紫紅色或黃綠色，當地主要制作綠茶、紅茶。樣品采集方法為隨機采摘茶樹芽下第三至第五片葉，每份資源采集10 片以上完整、無病蟲害、長勢正常的葉片樣品，采下后擦拭干凈，放入樣品袋并登記編號，立即用液氮或干冰速凍，并及時運送至－80 ℃冰箱中保存。在野外調查中如不能及時對葉片進行低溫保存，則先剪取茶樹枝條，將枝條剪口浸泡在盛有清水的瓶中，或用有濕布的袋子包好，或將枝條切口直接插入新鮮蘿卜中，保持葉片新鮮，并及時帶回有條件保存的地方。帶回后立即采集葉片放入樣品袋，登記編號，置于－80 ℃冰箱中保存。對保存的樣品及時開展提取和分析。

表1 55份茶樹種質資源樣品來源及對應編號

1.2 研究方法

SSR 分析主要包括樣品基因組DNA 提取、SSR 引物篩選及引物PCR 擴增、電泳檢測、數據分析等步驟。

1.2.1 基因組DNA的提取

采用由生工生物工程（上海）股份有限公司提供的Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒對55份茶樹材料DNA 進行提取，利用柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒，通過Buffer PCR 裂解茶樹葉片樣品，釋放出基因組DNA，采用特殊吸附膜選擇性吸附核酸分子，去除其他雜質，得到高質量的基因組DNA，提取后及時放入－20 ℃環境中保存備用。

1.2.2 SSR引物的篩選

SSR引物的篩選由生工生物工程（上海）股份有限公司負責，經篩選，選用TM241、TM262、TM341、TM345、TM369、TM442、TM426、TM428、TM440、TM442、TM447、TM461、TM499、TM513、TM569、TM601 共計16 對SSR引物，引物序列信息見表2。

表2 16對多態性引物序列信息

1.2.3 SSR-PCR擴增和電泳檢測

主要操作步驟包括：（1）取96 孔反應板，用記號筆標明板名、試驗日期。（2）制作電子版SSR檢測表，并自動生成上機表。（3）使用連續加樣器，吸取990 μL HIDI 和10 μL LIZ500 的混合物，加入到96 孔反應板中，每孔10 μL。（4）將96 孔板置于平板離心機中，用1 200 r/min 離心15 s。（5）使用12 排10 μL 排槍，對照SSR 檢測表，在96 孔板對應的孔中加入1 μL樣品。（6）將96 孔板置于平板離心機中，1 200 r/min 離心15 s。（7）使用封板膜密封96孔板，振蕩，將96孔板置于平板離心機中，1 200 r/min 離心30 s，置于PCR 儀。（8）變性。變性程序為溫度98 ℃，時間5 min。變性程序結束后立即將96 孔板置于冰水混合物上急速冷卻。（9）將96 孔板置于平板離心機中，用1 200 r/min離心15 s。（10）使用3730 ⅩL測序儀進行毛細管電泳檢測SSR 樣本。PCR 反應體系和擴增條件見表3、表4。

表3 SSR-PCR 擴增反應體系

表4 SSR-PCR擴增條件

1.2.4 數據分析

采用Gnemapper v4.0軟件進行序列分析，通過PopGen32 軟件計算觀測等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態信息含量（PIC）、Shannon多樣性指數（I）、遺傳分化系數（Fst）、基因流（Nm）等指標，用MEGA 5.1軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 SSR位點多態性分析

通過16 對SSR 引物對8 個縣（市、區）共55份樣品進行位點多態性分析（表5），16 對SSR 引物共擴增出189 個多態位點，每對引物為3～20個，平均每對引物11.812 5個多態位點。

表5 16對SSR引物的遺傳多樣性參數

Ne 是反映群體遺傳變異大小的指標，其數值越接近Na 的絕對數，表明該等位基因在群體中分布越均勻；Ne和Na差異越大，說明等位基因在群體中分布越不均勻。16對SSR引物的Ne值范圍為1.100 1～11.237 0，均值為5.826 4。

PIC 是評價引物位點多態性的重要指標，當PIC＞0.50 時，表明該位點為高度多態位點；當0.25＜PIC≤0.50 時，表明該位點為中度多態位點，當PIC≤0.25時，表明該位點為低度多態位點。

16對引物的PIC值范圍為0.305 5～0.904 2，均值為0.698 7，其中有13 對引物的PIC 值大于0.50，說明引物絕大多數為高度多態性SSR標記。

2.2 群體遺傳多樣性分析

Ho 指隨機抽取的兩個樣本等位基因不相同的概率；He指理論計算得出的雜合度，He的范圍從0（說明無多態性）到1（說明無限多個等位基因具有相同的頻率，是個極限值）。一般常用He來衡量群體的遺傳多樣性高低，He 越高，反映群體的遺傳一致性越低，其遺傳多樣性越豐富。Ho 小于He，說明位點純合子偏多；Ho大于He，說明位點雜合子偏多；Ho 等于He，說明位點處于平衡狀態。由表5 可知，16 對SSR 引物Ho 為0.056 6～0.836 4，均值為0.539 1；He 為0.091 8～0.919 5，均值為0.723 8，且16 對引物中，有12 對的He 均在平均值以上，說明55 份資源的遺傳多樣性豐富；但是，Ho 平均值明顯低于He 平均值，且16對引物的Ho均低于He，說明幾乎所有位點都出現了純合子偏多的現象，這可能是因為在清遠境內屬小群體分布模式，容易引起近交，從而導致群體內純合子數量增加。

I也叫香農指數，是比He更能反映遺傳多樣性程度的指標，I 越大，表明群體離散度越高，遺傳多樣性越豐富。16對SSR引物I值0.221 8～2.635 6，均值為1.796 8，其中，有8對引物的I大于2.0，進一步說明55份資源的遺傳多樣性比較豐富。

遺傳分化是指遺傳多樣性在群體內和群體間的分布，Fst代表不同群體間的遺傳分化水平，Fst值在0～1 之間。一般來說，Fst 值小于0.05，說明物種群體間的遺傳分化水平很低；Fst 值在0.05～0.15之間，說明群體間的遺傳分化水平處于中等程度；Fst 值在0.15～0.25 之間，說明群體間的遺傳分化水平處于中等偏高的程度；當Fst 值大于0.25，說明群體間的遺傳分化水平處于較高程度。55個樣品的Fst平均值為0.128 8，說明55份清遠野生茶樹資源的遺傳分化水平中等，同時也說明有87.12%的遺傳分化來自群體內，12.88%的遺傳分化來自群體間。

Nm是指生物個體從其發生地分散出去而導致不同種群之間基因交流的過程，可發生在同種或不同種的生物種群之間。基因的交流會削弱種群間的遺傳差異，是影響種群遺傳結構的重要因子。一般來說，當Nm＞1時，表明群體間的Nm水平較高，能足以防止遺傳漂變導致種群遺傳分化的發生；Nm＜1，則表明是由遺傳漂變導致群體間的遺傳分化。55個樣品的Nm平均值為1.917 0，說明55份資源群體間的Nm水平較高，遺傳分化不是由遺傳漂變產生的。

2.3 群體親緣關系分析

不同種質資源的親緣關系與其遺傳背景有直接關系，遺傳背景越近，則相似程度就越高。根據SSR標記計算55份樣品的遺傳相似系數介于0～0.834 1之間，遺傳距離介于0～3.827 7之間，通過MEGA 5.1軟件對55個樣品進行聚類分析發現，以遺傳距離0.53為閾值，55份茶樹資源被聚為7個類群，其中，第一類群共30 份種質資源，第二類群共6份資源，第三類群共10份資源，第四類群共1份資源，第五類群共1份資源，第六類群共6份資源，第七類群共1 份資源。以遺傳距離0.40 為閾值，第一類群又可以分為4個亞群，第二類群和第三類群也分別分為3個亞群。另外，從樣品來源地角度分析，英德市的4個樣品聚類在一起，說明英德市的4 個樣品親緣關系近；連南縣12 個樣品在遺傳距離為0.50 處主要分為兩大類群，其中序號25、26、29、30、31 聚類在一起，序號21、22、23、24 聚類在一起，其余幾個樣品沒有形成明顯聚類；其他6 個縣（市、區）的樣品，整體來看，尚未發現明顯聚類（圖1）。

圖1 55個樣本Nei's遺傳距離聚類分析樹狀圖

2.4 各縣（市、區）樣品遺傳多樣性分析和親緣關系分析

2.4.1 各縣（市、區）樣品遺傳多樣性分析

遺傳多樣性對于種群或物種的長期存活及凈化潛力至關重要，分析物種遺傳多樣性的空間分布有助于識別不同的遺傳群體。由表6 可以看出，以I 值計，清新區的遺傳多樣性指數最高，I 值為1.548 2，He值也最高（0.741 5）；陽山縣（1.471 4）排名第二，清城區（1.374 6）排名第三，對應He也排名前列；英德市的遺傳多樣性水平最低，I、He值也在8個縣（市、區）中最低，分別為0.994 1、0.598 2。

Hardy-Weinberg 遺傳偏離指數D（Ho－He）主要反映Ho 和He 之間的平衡關系，D 值越接近0，基因型分布就越接近于平衡狀態，D 值大于0，說明存在雜合子過剩；D 值小于0，說明存在雜合子缺失現象。由表6 可以看出，8 個縣（市、區）的群體Ho 均小于He，說明均表現出雜合子缺失、純合子偏多的現象。其中，英德市的遺傳偏離指數D為－0.0513，最接近于平衡狀態。陽山縣的遺傳偏離指數D為－0.2349，最遠離平衡狀態，純合子最多，近交程度也最高。

表6 各縣（市、區）遺傳多樣性分析

2.4.2 各縣（市、區）樣品一致度和遺傳距離分析

遺傳一致度越高，表明供試茶樹品種間遺傳距離越近，親緣關系越近。通過對8 個不同來源地，即8個縣（市、區）樣品遺傳一致度和遺傳距離分析，結果（表7）顯示，8 個群體的遺傳一致度范圍為0.554 3～0.842 7，遺傳距離范圍為0.171 1～0.590 0。陽山縣和清城區群體間遺傳一致度最大（0.842 7），遺傳距離最小（0.171 1），說明陽山縣和清城區2個群體的遺傳背景較相似，親緣關系較近；清新區和連南縣的遺傳一致度次之（0.836 4）；而連南縣和英德市的遺傳一致度最小（0.554 3），遺傳距離最大（0.590 0），說明連南縣和英德市材料的遺傳背景有較大差異，親緣關系較遠。總體來說，8 個縣（市、區）樣品的遺傳一致度都在0.55以上，遺傳分化程度較低。

表7 不同來源地材料遺傳一致度（對角線以上）和遺傳距離（對角線以下）

此外，從群體聚類分析樹狀圖（圖2）也可以看出，在遺傳距離為0.20處，8個縣（市、區）的樣品可聚類為兩大類，其中群體5（英德市）單獨聚類，其余群體聚類在一起，說明英德市群體與其余群體的親緣關系較遠；而在遺傳距離為0.1 處，陽山縣和清城區聚類在一起，清新區和連南縣聚類在一起，其余4個縣（市、區）分別聚類，這和表7中關于遺傳相似系數和遺傳距離的分析一致，進一步驗證了各縣（市、區）的親緣關系情況。

圖2 各縣（市、區）Nei's遺傳距離聚類分析樹狀圖

3 小結與討論

茶樹資源是茶樹品種創新和新品種選育開發的重要基礎，對實現茶葉優質高效發揮著重要作用[28]，遺傳多樣性作為生物所攜帶遺傳信息的總和，對分析重要性狀和輔助育種起著不可替代的作用[29-30]，因此，通過遺傳多樣性分析對茶樹種質資源及遺傳育種進行研究，越來越受到廣大學者的關注。本研究的55 份清遠野生茶樹種質資源的Ho 平均值為0.539 1、He 平均值為為0.723 8、I 平均值為1.796 8、PIC平均值為0.698 7，一定程度說明清遠種質資源的遺傳多樣性比較豐富[31-32]；55份資源的Fst 為0.128 8、Nm 為1.917 0，說明群體間存在一定的遺傳分化，但遺傳分化不是由遺傳漂變引起，可能與不同來源地海拔高度或地域差距所處各種生態因子（如氣候、溫度、土壤等）的差異性有關。

通過聚類分析，55 份茶樹資源可聚為7 個類群，其中，來自陽山縣的資源19 號、來自佛岡縣的資源49號、來自連州市的資源37號分別單獨聚類，可作為進一步分析的目標樹種。本研究中，來自8 個縣（市、區）的55 份茶樹種質資源在遺傳水平上的分類結果與其資源來源地分類結果并不完全一致，分析可能是清遠本土茶樹資源在清遠市域內自然雜交和引種頻繁，導致區域內部茶樹群體種相互混雜。從分布地域來看，清新區的遺傳多樣性水平最高，陽山縣次之，英德市最低；8 個縣（市、區）的Ho 均小于He，即存在純合子偏多的現象，其中英德市最接近于平衡狀態，陽山縣最遠離平衡狀態。同時，清新區、陽山縣的遺傳多樣性水平相對豐富，具有足夠的更新能力，但陽山縣的近交程度最高，這也說明，部分群體可能具有較高的遺傳多樣性，但由于近交增加，可能導致群體衰退，所以，可以考慮創造更多的條件使群體內充分異交，以維持群體較高的遺傳多樣性。英德市的近交程度最低，但遺傳多樣性水平也最低，因此，也可以考慮創造條件增加群體異交，以提高群體遺傳多樣性。總體來說，清遠野生茶樹資源間的遺傳差異較大，遺傳基礎較寬，具有比較豐富的遺傳多樣性。這為今后進一步挖掘、利用清遠野生茶樹種質資源，篩選培育茶樹新品種，開發茶葉新產品提供參考。