核苷類似物拉米夫定與恩替卡韋對大鼠慢加急性肝衰竭的影響

顧宇峰，譚曉慧，朱雪娟，湯偉，張彬，汪曉鶯，朱軼晴

(1南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001；2南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

慢加急性肝衰竭(ACLF)是指在慢性肝病基礎(chǔ)上，短期內(nèi)發(fā)生急性或亞急性肝功能失代償?shù)呐R床癥候群[1,2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在ACLF的免疫病理機(jī)制中，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素17(IL-17)等炎性因子可能發(fā)揮了較為重要的作用。一項(xiàng)1 977例肝衰竭研究證明，ACLF仍是我國肝衰竭中最常見的類型，其中HBV相關(guān)ACLF約占90.29%[3]。目前，ACLF仍以內(nèi)科綜合治療為主，必要時(shí)輔以人工肝支持或行肝移植術(shù)。自2006年版《肝衰竭診療指南》提出：對HBV-DNA陽性的肝衰竭患者,在知情同意的基礎(chǔ)上可盡早酌情使用核苷類似物如拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋等[4]。近年來，核苷類似物拉米夫定、恩替卡韋被廣泛用于HBV相關(guān)ACLF的治療，并取得較好的效果[5～10]。然而，在臨床上，我們時(shí)有遇到一些HBV相關(guān)ACLF患者，在加用恩替卡韋或拉米夫定治療后，病情不僅未能得到良好控制反而進(jìn)一步加重的情況，其原因尚未明確。2013年3月～2014年3月，我們構(gòu)建大鼠ACLF模型，觀察核苷類似物恩替卡韋和拉米夫定對ACLF的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠40只,雄性，體質(zhì)量180～200 g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。生產(chǎn)許可證號(hào)：SC×K(蘇)2008-0010；使用許可證號(hào)：SC×K(蘇)2007-0021。

1.1.2 藥物與試劑 拉米夫定(葛蘭素史克制藥有限公司，批號(hào)12090858)，每日臨用前以滅菌生理鹽水配制成濃度為21 mg/mL的溶液。恩替卡韋(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)1210668)，每日臨用前以滅菌生理鹽水配制成濃度為0.105 mg/mL的溶液。四氯化碳(CCl4，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110601)，將其與橄欖油(上海嘉里食品有限公司)按體積比混合配制成40% CCl4溶液。細(xì)菌脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司，批號(hào)L4516；D-氨基半乳糖(D-Gal)購自美國Sigma公司，批號(hào)G0500；豬血清購自廣州蕊特生物科技有限公司，批號(hào)111220。IL-17、TNF-α ELISA試劑盒均購自美國eBiosience公司，批號(hào)分別為69595004、69816030；HE染色試劑盒購自德國默克公司，批號(hào)G1120。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將40只SD大鼠先隨機(jī)分為兩組，其中對照組8只、實(shí)驗(yàn)組32只。待實(shí)驗(yàn)組慢性肝損傷模型建成后，將其再隨機(jī)分為模型組8只、拉米夫定組12只、恩替卡韋組12只。

1.2.2 大鼠ACLF模型制備 參照譚曉慧等[11]的方法，除對照組外，實(shí)驗(yàn)組均腹腔注射40% CCl41 mL/kg(2次/周)及豬血清0.5 mL(1次/周)，持續(xù)4周，以誘導(dǎo)慢性肝損傷；對照組腹腔注射相同體積生理鹽水。慢性肝損傷模型建成后，實(shí)驗(yàn)組大鼠均給予D-Gal 0.3 g/kg及LPS 30 μg/kg腹腔內(nèi)注射1次，以誘導(dǎo)ACLF；對照組腹腔注射相同體積的生理鹽水。

1.2.3 藥物干預(yù) 于聯(lián)合注射D-Gal及LPS 6 h后，拉米夫定組及恩替卡韋組大鼠分別給予拉米夫定10 mg/kg(相當(dāng)于成人60 kg體質(zhì)量服用100 mg)或恩替卡韋 0.05 mg/kg(相當(dāng)于成人60 kg體質(zhì)量服用0.5 mg)灌胃，1次/d，連續(xù)3 d；對照組及模型組大鼠給予相同體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)3 d。

1.2.4 肝功能和血清TNF-α、IL-17檢測 分別于慢性肝損傷造模4周和誘導(dǎo)ACLF后24、72 h各采血1次，采血前24 h禁食不禁水。大鼠眼球后眥靜脈叢取血，靜置30 min后以3 000 r/min離心20 min,分離血清，立刻檢測肝功能指標(biāo)(ALT、AST、TBIL)。末次血清分為2份，分別檢測肝功能指標(biāo)和TNF-α、IL-17。血清TNF-α、IL-17檢測采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說明操作。以標(biāo)準(zhǔn)品測試后求得回歸方程分別為y(TNF-α)=647.11x2+1 487.61x-71.838、y(IL-17)=-65.862x2+179.85x-5.984 6，將各血清標(biāo)本的OD值代入此回歸方程計(jì)算出其相應(yīng)濃度。

1.2.5 肝組織病理檢查 于腹腔注射D-Gal+LPS 72 h(末次取血)后，處死各組動(dòng)物。取相同部位肝臟組織約1 cm×1 cm，置于10%甲醛溶液中固定24 h；常規(guī)石蠟包埋，以切片機(jī)切成4 μm切片。采用HE染色和Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝照片。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 對照組大鼠活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)有光澤，飲食、大小便均正常，體質(zhì)量持續(xù)增加，無死亡現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組大鼠隨著CCl4及豬血清給藥時(shí)間的延長，活動(dòng)逐漸減少,精神萎靡，毛發(fā)疏松無光澤，進(jìn)食量減少,常排不成形大便,體質(zhì)量增長緩慢。在給予D-Gal、LPS急性攻擊后24～48 h內(nèi)，拉米夫定組死亡2只，模型組及恩替卡韋組無動(dòng)物死亡。

2.2 各組大鼠慢性肝損傷時(shí)的肝功能指標(biāo)比較 CCl4及豬血清注射4周后，實(shí)驗(yàn)組及其他各干預(yù)組血清AST、ALT、TBIL均高于對照組(P均<0.05)，而模型組、拉米夫定組、恩替卡韋組3組間血清AST、ALT、TBIL水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 慢性肝損傷造模4周時(shí)各組大鼠肝功能指標(biāo)比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 各組大鼠誘導(dǎo)ACLF后24、72 h肝功能指標(biāo)比較 在誘導(dǎo)ACLF后24 h，拉米夫定組中8只(67%)、恩替卡韋組中7只(58%)大鼠血清AST、ALT、TBIL均超過模型組均值。拉米夫定組和恩替卡韋組血清AST、ALT、TBIL均高于模型組(P均<0.05)，拉米夫定組血清AST、ALT、TBIL均高于恩替卡韋組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在誘導(dǎo)ACLF后72 h，模型組、拉米夫定組、恩替卡韋組血清AST、ALT、TBIL較24 h時(shí)均下降(P均<0.01)；但拉米夫定組血清ALT、TBIL均仍高于模型組(P均<0.05)，拉米夫定組血清AST雖高于模型組但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；恩替卡韋組血清AST、ALT、TBIL雖均高于模型組但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其血清AST、ALT、TBIL雖均低于拉米夫定組但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 誘導(dǎo)ACLF后24、72 h各組大鼠肝功能指標(biāo)比較

注：與對照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05，#P<0.01；與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，△P<0.05，▲P<0.01；與同組誘導(dǎo)ACLF后24 h比較，○P<0.01。

2.4 各組大鼠誘導(dǎo)ACLF后72 h血清TNF-α和IL-17水平比較 誘導(dǎo)ACLF后72 h，模型組、拉米夫定組、恩替卡韋組大鼠血清TNF-α、IL-17均高于對照組，但此兩種因子水平在四組大鼠間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FTNF-α=1.131，P=0.357；FIL-17=0.608，P=0.617)。見表3。

表3 誘導(dǎo)ACLF后72 h各組大鼠血清TNF-α和IL-17水平比較

2.5 各組大鼠肝臟病理檢查情況 ①HE染色：正常組可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常、排列有序，呈條索狀圍繞中央靜脈，匯管區(qū)無炎細(xì)胞浸潤，膽小管細(xì)胞無腫脹。模型組可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成，肝細(xì)胞排列紊亂，空泡化，肝細(xì)胞局灶性壞死，肝竇擴(kuò)張，匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤。 拉米夫定組、恩替卡韋組所見與模型組大致相仿，但肝細(xì)胞局灶性壞死較模型組多見，且可看到片狀壞死；拉米夫定組較恩替卡韋組重。②Masson染色：正常組血管周圍偶見少量細(xì)短藍(lán)色纖維。模型組、拉米夫定組和恩替卡韋組肝臟組織中纖維明顯增多，可見相互連接形成的纖維間隔。

3 討論

HBV相關(guān)ACLF是慢性乙型肝炎或乙肝肝硬化患者因某種原因誘發(fā)嚴(yán)重急性肝損傷而導(dǎo)致的急性或亞急性肝衰竭，其病情演變過程如其他原因所致的肝衰竭一樣可分為重癥傾向期、上升期、平臺(tái)期和恢復(fù)期[12,13]。HBV相關(guān)ACLF的發(fā)病機(jī)制不僅與體內(nèi)的HBV復(fù)制狀況有關(guān)，更與機(jī)體免疫系統(tǒng)對HBV的清除有關(guān)。體內(nèi)的HBV載量升高或基因變異可誘發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的免疫清除，使大量HBV感染的肝細(xì)胞損傷，這往往只是ACLF的始動(dòng)因素[14,15]；而HBV免疫清除過程中產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，則可能是引起肝組織進(jìn)一步大量損傷，乃至肝衰竭發(fā)生的關(guān)鍵原因。

在本研究中，我們以CCl4聯(lián)合豬血清誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生慢性肝損傷，再給予D-Gal、LPS聯(lián)合攻擊以誘導(dǎo)ACLF，并對拉米夫定組和恩替卡韋組大鼠在聯(lián)合攻擊后分別按成人劑量給予拉米夫定或恩替卡韋灌胃。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們觀察到給予D-Gal、LPS聯(lián)合攻擊24 h后，各處理組大鼠肝功能指標(biāo)均較攻擊前大幅度升高，且拉米夫定組和恩替卡韋組肝功能損傷較未服用核苷類似物的模型組更高，但恩替卡韋組肝功能指標(biāo)低于拉米夫定組；聯(lián)合攻擊24～48 h，拉米夫定組中有2只死亡；聯(lián)合攻擊72 h后，模型組、拉米夫定組和恩替卡韋組肝功能指標(biāo)均較攻擊24 h時(shí)下降，但拉米夫定組和恩替卡韋組仍明顯高于模型組。這一結(jié)果提示，在ACLF發(fā)生的急性發(fā)作期或肝功能指標(biāo)上升期，給予核苷類似物拉米夫定或恩替卡韋服用，均有可能加重肝組織損傷，且以拉米夫定稍重；但當(dāng)病程進(jìn)入平臺(tái)期后，繼續(xù)服用此兩種核苷類似物則對肝組織損傷的修復(fù)無明顯影響。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，多數(shù)發(fā)生肝臟重度炎癥或重型肝炎患者血清TNF-α水平增高[16,17]。實(shí)驗(yàn)研究表明，TNF-α不僅能介導(dǎo)內(nèi)毒素或LPS對肝細(xì)胞的損傷，而且對肝細(xì)胞具有直接的損傷作用。肝臟發(fā)生炎癥病變時(shí)，肝組織Kupffer細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κB被激活，誘導(dǎo)包括TNF-α在內(nèi)的多種炎癥因子表達(dá)，TNF-α可直接誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡、壞死，其表達(dá)水平與炎癥病變程度呈正相關(guān)；而且，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予抗 TNF受體1中和抗體，可以明顯減輕肝損傷[18～20]。

IL-17是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種具有促炎癥作用的細(xì)胞因子，主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，其受體(IL-17R)在體內(nèi)廣泛表達(dá)尤其是在粒細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)；當(dāng)IL-17與IL-17R結(jié)合后可激活細(xì)胞，導(dǎo)致趨化因子、集落刺激因子和黏附分子的表達(dá)或釋放，招募和激活炎癥細(xì)胞尤其是嗜中性粒細(xì)胞，介導(dǎo)或加強(qiáng)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)病原體的清除和自身免疫病理損害[21]。有實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告，予以IL-17中和抗體可以明顯降低自身免疫性肝炎模型小鼠血清ALT水平，且肝組織炎癥病變減輕[22]。在臨床上觀察到，慢性乙型肝炎發(fā)作時(shí)，血清IL-17水平與ALT、TBIL、凝血酶原時(shí)間呈正相關(guān)，HBV相關(guān)ACLF患者血清IL-17水平高于失代償性乙肝肝硬化患者；HBV相關(guān)ACLF患者Th17細(xì)胞及血清IL-17水平升高，且血清IL-17水平與終末肝病模型(MELD)評分呈正相關(guān)，預(yù)后不佳者血清IL-17水平高于預(yù)后好轉(zhuǎn)者[23～25]。這些研究結(jié)果提示，在ACLF的發(fā)病機(jī)制中，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致肝組織嚴(yán)重?fù)p傷和肝功能衰竭的關(guān)鍵原因。

為了解核苷類似物加重肝損傷的機(jī)制，我們檢測了誘導(dǎo)ACLF后72 h各組動(dòng)物的血清TNF-α及IL-17水平。結(jié)果顯示，拉米夫定組和恩替卡韋組血清TNF-α、IL-17水平高于模型組，但3組間差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對此結(jié)果，可作兩方面分析：其一，檢測標(biāo)本留取時(shí)間太遲(給予D-Gal和LPS急性攻擊后72 h)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝損傷已較急性攻擊后24 h明顯改善，但此時(shí)兩個(gè)核苷類似物治療組血清TNF-α、IL-17水平尤其是拉米夫定組TNF-α水平仍較高，提示核苷類似物可能加重了D-Gal和LPS急性攻擊后產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。其二，與本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本數(shù)量較少有關(guān)。

張鶴等[26]對53例HBV相關(guān)ACLF患者血清HBV-DNA載量變化與疾病預(yù)后之間的關(guān)系進(jìn)行了回顧分析，認(rèn)為發(fā)病前及治療初期單一時(shí)間點(diǎn)HBV-DNA與預(yù)后關(guān)系不大；HBV-DNA升高或降低>2 log在存活組所占比率明顯低于死亡組，HBV-DNA維持不變或變化<2 log存活組則明顯高于死亡組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明上述改變模式在2組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果提示，在HBV相關(guān)ACLF發(fā)病初期，對HBV強(qiáng)烈的免疫清除很可能伴隨較為劇烈的肝臟炎癥損傷甚至預(yù)后不佳。結(jié)合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為對慢性乙型肝炎嚴(yán)重發(fā)作或HBV相關(guān)ACLF發(fā)病初期、病情迅速進(jìn)展的患者，應(yīng)首先給予抗炎保肝治療以期盡快抑制或減輕肝臟的炎癥病變，1周左右后再加用核苷類似物抑制HBV復(fù)制、減輕后繼對HBV免疫清除而引起的肝損傷，如此或許更有利于患者的康復(fù)。

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