基于全基因組和準種序列分析3株HAV流行株基因特征

黃騰達 周文亭 曹經瑗 畢勝利

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所

甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)是引起急性甲型肝炎的病原體，通過污染的水和食物及人群日常接觸經糞口途徑傳播。據世界衛生組織估計，全球每年約有150萬HAV感染病例[1]。HAV屬小RNA病毒科，肝病毒屬，基因組全長約7.5 kb，為單股正鏈RNA，包括5′非翻譯區、3′非翻譯區和一個開放讀碼框(opening reading frame, ORF)，編碼2 227個氨基酸殘基的多聚蛋白，經蛋白酶裂解為P1、P2及P3。其中P1區編碼結構蛋白VP1-VP4，P2和P3區編碼非結構蛋白，進一步水解為2 A、2B、2C和3A、3B、3C、3D。根據VP1-2 A連接區的核苷酸序列差異，將HAV分為六個基因型(I-VI)。感染人的HAV主要為I、II、III型，進一步分為A、B兩個亞型[1]。基因分型研究表明，我國流行的HAV為基因I型，其中絕大部分屬IA亞型[2]。目前HAV只有一種血清型，結構蛋白區氨基酸序列十分保守，其抗原中和位點主要位于結構蛋白VP3和VP1區[3]。

由于病毒RNA缺乏校正功能，在復制過程中形成同源性很高的基因序列群體，即準種(quasispecies)[4]。HAV準種及全序列分析將有利于甲肝病毒暴發流行的溯源研究。本研究對我國某地3株病毒的VP1-2 A區分型一致的序列進行了分析，成功擴增了HAV病毒近全長序列，并進一步分析準種特征，以了解相關序列的遺傳特征。

1 材料與方法

1.1標本來源及試劑收集2014年我國某地抗HAV-IgM陽性甲肝急性期患者血清標本3份(KH6.14、KH7.14、KH8.14),標本采集獲患者知情同意。抗HAV-IgM試劑盒購自北京萬泰公司；病毒核酸提取、質粒小提試劑盒購自Omega公司；DNA膠回收試劑盒購自QIAgen公司，RNasin購自Promega公司，逆轉錄酶SuperScript III購自Invitrogen公司；Premix Taq購自TaKaRa公司。

1.2引物設計和合成根據HAV全長序列，分9段設計18對引物。其中5′-UTR區分兩段分別采用巢式擴增：第一段：F1(1-21)：5′-TTCAAGAGGGGTGTCCGGAGT-3′; NR1(470-450): 5′-AATATCCGCCGCTGTTACCCT-3′; F2(18-38): 5′-GGAATTTCCGGAGTCCCTCTT-3′; NR2(451-429): 5′-CTATCCAAGGCATCTCTTCATAG-3′。第二段：NF1(341-361): 5′-CACCTTGCAGTGTTAACTTGG-3′; R1(786-768): 5′-GGTCAAGGCCACTCCCAAC-3′; NF2(367-388): 5′-ATGAACCTCTTTGATCTTCCAC-3′; R2(707-688): 5′-AATGCCCCTGAGTACCTCAG-3′。引物序列位置參照參考株HM175，其余片段引物序列參照文獻[5]，由華大基因公司合成引物。

1.3病毒核酸提取、逆轉錄取140 μl血清標本，按試劑盒說明書提取HAV RNA，分別溶解于40 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水中。取11 μl RNA模板，加入1 μl(20 μmol/L)外側下游引物R7或R15[5]，1 μl(10 mmol/L)dNTPs，65 ℃加熱5 min，取出立即冰浴5 min，按SuperScript III逆轉錄試劑盒說明書，依次加入5×Frist-Strand Buffer、0.1 M DTT、RNasin和逆轉錄酶，配制20 μl反應體系，55 ℃水浴1 h，然后70 ℃加熱15 min終止反應。

1.4巢式PCR擴增目的片段取5 μl cDNA產物，加入25 μl Premix Taq，外側上下游引物(10 μmol/L)各2 μl，16 μl DEPC處理水，構成50 μl反應體系，進行一輪PCR，反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s～90 s, 共35個循環；72 ℃ 10 min。取一輪PCR產物2 μl，使用內側上下游引物，進行二輪PCR反應。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶，由擎科生物公司進行序列測定。

1.5VP1-2A區克隆測序膠回收純化HAV VP1-2 A區PCR產物片段(nt 2208-3286)，按pMD19-T Vector說明書將純化產物與載體連接，轉化到Trans5α大腸埃希菌感受態細胞中，根據藍白斑篩選原理，每份標本隨機挑取30個白斑，用plasmid mini kit進行質粒小提，由擎科生物公司進行序列測定。

1.6基因序列分析使用Lasergene 7.1及BioEdit軟件對各片段進行拼接校對及比對。從GenBank下載世界范圍內具有代表性的HAV參考株全基因序列13條，我國VP1-2 A連接區分型序列3條。使用Mega7.0軟件，Neighbor-Joining法，Kimura-2-parameter模型，Bootstrap值1 000，構建系統進化樹。使用RDP4軟件進行重組分析， Simplot軟件驗證結果。使用HyPhy軟件包(http://www.datamonkey.com)，SLAC法選擇最佳核苷酸替換模型，計算dN/dS值，dN和dS分別代表非同義替換率和同義替換率，其中dN/dS>1、dN/dS<1和dN/dS=1分別表明序列處于正向、負向及中性選擇[6]。

1.7統計學方法使用SPSS 19.0進行統計學分析，克隆序列中標本內和標本間基因進化距離的比較采用Wilcoxon秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義[7]。

核苷酸變異數為各流行株所有克隆序列中與一致序列不同的核苷酸數目，氨基酸變異數為各流行株所有克隆序列中發生非同義替換的氨基酸數目。香農熵值用來反映準種變異特征，其計算公式為：SN/SNA=- [∑i (pi × ln pi)] / ln N，pi為每種獨特序列(核苷酸或氨基酸序列)在病毒群體中出現的頻率，N為克隆序列總數，香農熵從0(最小多樣性)到1(最大多樣性)。

2 結果

2.1VP1-2A連接區基因分型及三株流行株序列間同源性分析VP1-2 A連接區(321 bp)系統進化樹表明，3株流行株核苷酸、氨基酸序列同源性均為100%，均屬于IA亞型，如圖1所示。與GenBank中最近的是廣西GgGx4.06株，同源性為99.4%；其次是日本AH2株，同源性為99.1%。

3株流行株間全基因組核苷酸同源性為99.9%～100%，存在2～7個核苷酸差異，位于5′端非編碼區及非結構蛋白2C、3 A和3D區；全編碼區氨基酸同源性為100%。

表1 3株流行株在部分VP1區和VP1-2 A連接區準種變異特征Tab.1 Characteristics of quasispecies spectrum in partial VP1 and VP1-2 A region of three strains

2.23株流行株全基因組序列與GenBank中HAV參考株間同源性分析基于全基因組構建系統進化樹表明，3株流行株均屬于IA亞型，與GenBank中選定的IA亞型參考株全基因組核苷酸同源性為96.0%～98.5%，其中與AH2株親緣關系最近，同源性為98.5%，全編碼區氨基酸同源性為99.0%～99.7%。與選定的其他型別參考株全基因組核苷酸同源性為79.0%～90.7%，全編碼區氨基酸同源性為93.1%～98.7%，如圖2所示。

2.3抗原中和位點分析文獻[8]中報道的抗原中和位點如VP3：Pro65、Asp70、Ser71、Gln74，VP1：Ser102、Asn104、Lys105、Ser114、Val166、Trp170、Val171、Ala176、Lys221、Gln232，以及基于結構預測發現的表位VP2：Thr71和Ala198[9]。本研究中3株流行株序列在已發表的抗原中和位點處未發生氨基酸變異。

2.4重組及選擇壓力分析分別針對不同基因片段構建系統進化樹，流行株與參考株親緣關系結果并不一致，例如基于5′-UTR區建樹，雖然流行株與AH2株在同一分支，但進化距離明顯更遠，如圖3所示；基于2B區建樹，流行株與MNA12-130株親緣關系更近；而基于3C區建樹，AH2株與MNA12-130株自成一支(圖省略)。但通過RDP4和Simplot分析未發現明顯的亞型內重組事件。3株流行株選擇壓力分析，全編碼區與結構蛋白編碼區平均dN/dS值分別為0.028和0.015，均未發現正選擇位點。

2.5準種特征分析3株流行株序列全長VP1-2 A區克隆測序，共得到78條有效序列(各株為26條序列)。使用所有克隆序列構建系統進化樹，序列間呈現無規律的散狀分布，如圖4所示。每株流行株內的克隆序列，核苷酸和氨基酸同源性分別為99.0%～100%和98.1%～100%；在所有流行株中克隆獲得的序列之間，核苷酸和氨基酸同源性分別為99.0%～100%和97.2%～100%。克隆序列中標本內的平均基因進化距離為0.0034，標本間的平均基因進化距離為0.0035，差異無統計學意義(P>0.10)。將序列分為部分VP1區(nt 2208～2897)和VP1-2 A連接區(nt 2898～3286)，比較3株流行株各自的核苷酸和氨基酸變異率，VP1-2 A連接區均高于部分VP1區，如表1所示。

“●”表示本研究中的流行株圖1 VP1-2 A連接區核苷酸序列系統進化分析“●”indicates HAV isolates in this studyFig.1 Phylogenetic analysis based on VP1-2 A junction region

“●”表示本研究中的流行株圖2 基于全基因組構建系統進化樹“●”indicates HAV isolates in this studyFig.2 Phylogenetic analysis based on whole-genome region

“●”表示本研究中的流行株圖3 基于5′-UTR區構建系統進化樹“●”indicates HAV isolates in this studyFig.3 Phylogenetic analysis based on 5′-UTR region

圖4 3株流行株克隆VP1-2 A區序列系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of cloning sequences based on VP1-2 A region

3 討論

隨著我國城市化進程的加速，衛生環境的改善以及疫苗的廣泛使用，全國甲肝的年發病率已由1990年的52.6/10萬，降至2012年的1.82/10萬[10]。然而，每年小規模的甲肝散發或暴發事件在各省市仍時有發生，給當地公共衛生和疾病防控工作帶來挑戰。通過HAV分子流行病學研究，將基因分型與現場流行病學調查相結合，利于甲肝病毒的溯源調查[11]。在所有基因片段中，VP1-2 A連接區常用于基因分型[12]，已成功對多起HAV食源性或水源性暴發事件進行了基因分型和傳播溯源[13-15]。

本研究的3份甲肝患者血清標本，在VP1-2 A連接區核苷酸同源性100%，均屬于IA亞型。病毒全長序列的核苷酸和氨基酸同源性分別為99.9%-100%和100%，即核苷酸差異為0.0%～0.1%。有文獻報道[16]，在VP1-2 A分型片段完全一致的HAV序列中，同源暴發序列其全基因組核苷酸差異可達到0.31%，而非同源暴發相關的序列則更高，可達到0.42%～0.88%。據此推測本實驗3株流行株可能來自同一起感染事件。因此獲得HAV全基因組序列，結合現場流行病學調查，能夠對同源暴發事件進行精確溯源。

同一年份同一地區的流行株可分屬于不同分支，如Bj5.07和Bj46.07處于兩個不同的分支；不同年份不同地區的流行株可分布于同一分支，如LU38與BbGx3.06具有完全一致的序列，提示我國甲肝流行的復雜性。HAV只有一個血清型，其抗原中和位點主要分布在結構蛋白VP3和VP1編碼區，近年發現VP2編碼區的第71位、第198位氨基酸也為抗原中和位點[9]。本研究3株流行株序列在已發表的抗原中和位點處均未發生氨基酸變異。監測流行株的抗原中和位點氨基酸變異情況，對甲肝疫苗的使用具有重要意義。本研究流行株中未檢測到重組現象，今后隨著GenBank中全序列的不斷增多，可進一步驗證。

全長VP1-2A區克隆測序分析，各流行株的克隆序列間呈無規律的散狀分布。流行株內克隆序列、所有克隆序列間核苷酸與氨基酸同源性均較高(分別為99.0%～100%、98.1%～100%和99.0%～100%、97.2%～100%)，且克隆序列中標本內和標本間的平均基因進化距離差異無統計學意義，表明流行株間親緣關系比較近。流行株在VP1-2A連接區的核苷酸和氨基酸變異率均高于部分VP1區，因而VP1-2A連接區被廣泛應用于基因分型。本研究觀察到KH8.14在3株流行株中核苷酸和氨基酸變異率、香農熵均最低，這可能是由于病毒在宿主體內經受的免疫壓力不同，或標本收集時間不同所致。此外，克隆測序方法選擇的準種數量有限也可能產生影響。今后應用新一代測序技術等手段，可增加測序廣度和深度，通過分析基因組不同區段的準種特性或不同感染來源的流行株準種特點，結合現場流行病學調查，為甲肝溯源和分子流行病學分析提供更為詳盡的信息。

利益沖突:無

參考文獻

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