病毒學實驗室資質認定中非標方法的確認研究

李潔 何小周 楊夢婕 馬學軍 武桂珍

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所

中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(以下簡稱病毒病所)擔負著研究新的實驗方法，建立與制定標準，技術指導全國病毒病防控工作等任務。有些實驗方法需要提升到國家標準、行業標準高度。其中一些非標方法(自制方法)相比于國標方法、行標方法具有獨特的優勢。通過檢驗檢測機構資質認定工作(又稱實驗室資質認定)，可以將這些成熟的方法通過資質認定的法定程序予以確認，進而轉化成為本所標準，使用該方法得到的檢測結果就具備了一定的法律效力[8,13]。

1 方法確認的依據

按照實驗室資質認定評審準則的要求[1-4]，對非標方法進行技術確認的主要原則應包含：(1)使用參考標準或標準物質進行比較；(2)與其他方法所得的結果進行比較；(3)實驗室間檢測結果的比對；(4)對影響結果的因素作系統性評審；(5)根據對實驗方法理論原理和實踐經驗的科學理解，對所得結果不確定度進行評定。

非標方法的確認除其他程序完備外，一般需要有三個或以上的比對試驗，可以有以下幾種辦法：1)組織學術評審會，邀請專家，通過學術評審確定方法的可行性、適應性和有效性。2)實驗室內方法確認(in-house method validation):同一實驗室內，在合理的時間間隔內，用一種方法在預定條件下對相同或不同測試樣品進行的分析實驗。亦可由本室不同人員通過留樣再測，進行不同批次的實驗比對[5-7,11]。3)實驗室間方法確認(inter-laboratory method validation)是指在兩個或多個實驗室之間實施的方法確認。各實驗室依照預定條件用相同方法對相同樣品進行測定。包括在本所或外所不同的實驗室對該方法進行重復，以實現在不同地點的實驗比對[5-7,11]。4)與其他標準方法比對。5)與標準品檢測結果比對。結合資質認定《檢驗檢測機構資質認定評審準則》(國認實[2016]33號)[3]和國際標準《檢測或校準實驗室能力認可準則》ISO/IEC：17025的規則要求，本研究就比對方法進行梳理[5-7]。需要說明的是，下述介紹的各種比對結果評價中，要用到一個重要的參數是測量不確定度，而對于病毒學方法的的評價指標主要是特異性，穩定性和可靠性等，難以套用測量不確定度的計算公式，病毒學方法應該依照資質認定的原則框架進行比對試驗，但具體判定規則應按照本專業規則和圖表進行判定和表達。

2 比對方法(試驗)[9-14]

2.1人員比對在相同的環境條件下，采用相同的檢測方法、相同的檢測設備和設施，由不同的檢測人員對同一樣品進行檢測的試驗。以參與比對試驗人員中具有較高準確度一方的測定值作為參考值，比對試驗結果進行評價。

2.2方法比對在環境條件相同的前提下，由相同的人員采用不同的檢測方法對同一樣品進行的檢測,對試驗結果進行評價。

2.3儀器比對在相同的環境條件下、使用相同的方法、由相同的檢測人員采用不同的儀器設備對同一樣品進行檢測的試驗。

2.4留樣再測在盡可能相同的環境條件下，采用相同的檢測方法、相同的檢測設備和設施，由相同的檢測人員對已完成檢測的樣品在其留樣保存期間進行再次檢測的試驗。

3 實證案例

以“RT-RAA法檢測 EV71/ CA16等病毒”方法為例，說明方法確認研究的要素。結合具體方法的實際情況，對原方法做適當驗證，補充和修正。

按照《檢驗檢測機構資質認定評審準則》(國認實[2016]33號)4.5.14要求。 按照病毒學實驗室質量體系文件《檢測方法控制程序》的要求，進行比對試驗驗證，具體使用的方法是留樣再測，人員比對。通過比對確認該方法的敏感性、特異性、穩定性，可靠性符合預期。“RT-RAA法檢測 EV71/CA16等病毒”方法采用了以下形式進行比對試驗驗證：由不同檢測人員非同一日對留樣進行3次實驗操作，3次實驗結果均為陰性對照無擴增曲線出現，陽性對照和樣品有明顯的擴增曲線，因此3次重復實驗樣品結果均判讀為CA16。通過比對確認該方法的特異性、穩定性和可靠性符合預期。

4 確認后的方法

調整后的“RT-RAA法檢測 EV71/CA16等病毒”方法[8]從形式上提升為病毒病所所內標準；程序上符合了實驗室資質認定的方法確認程序；內容上增加了技術要求、結果分析、檢驗規則、判定規則等條款。以下引用修改后的該標準：

——————中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所《標準》。標準編號：Q/IVDC024005-2017，標準名稱：《RT-RAA法檢測 EV71/ CA16等病毒》，發布時間2017年12月25日。

前言

關于本標準的基本概況：手足口病是人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病。引發手足口的病毒以腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型為主。傳統的檢測方法如多重PCR法和定量PCR法對硬件設備和操作人員的技術要求較高，且成本也高，故建立該快速準備易普及的檢測方法，對現場突發事件及實驗室大量檢測任務具有重大意義。根據《中華人民共和國標準化法》、《中華人民共和國產品質量法》特制訂本產品標準作為該檢測方法的質量依據。

本標準由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所中心實驗室提出

本標準主要起草人：馬學軍，王佶，楊夢婕，何小周

1 范圍

本標準建立了EV71/CA16等病毒的等溫核酸擴增方法，提高病原微生物快速檢測能力。

本標準適用于經過生物安全培訓的操作人員進行EV71/CA16等病毒感染病例標本的檢測。

2 規范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。

Use of a rapid reverse-transcription recombinase aided amplificationassay for respiratory syncytial virus detection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,chenChen,xuejunMa,et al. Available online 14 October 2017.

3 定義和術語

下列術語和定義適用于本標準。

重組酶介導等溫核酸擴增技術(Recombinase Aided Amplification，RAA)是一種利用重組酶、單鏈結合蛋白、DNA聚合酶在39 ℃等溫條件下對核酸進行擴增的技術，使用該技術在短時間內即可將目的基因擴增放大到幾百萬倍，達到可以用儀器檢測到的水平。

逆轉錄(Reverse Transcription，RT)提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA為模板，利用引物和逆轉錄酶反轉錄成cDNA。

柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16，CA16)是一種腸道病毒，導致手足口病的主要病原體之一。

腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是一種腸道病毒，引起嬰幼兒手足口病主要病原體之一。

4 技術要求(檢測方法)

4.1 試劑耗材及主要儀器設備

Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit(catalog #52904)；RT-RAA核酸擴增試劑盒(熒光法)；DEPC處理水(無RNA酶和DNA酶)；1.5 ml離心管,0.2 ml PCR反應管；200 μl、100 μl、10 μl帶濾芯的TIP；奇天基因熒光基因檢測儀(QT-RAA-F7200)；

RAA 8連管混勻儀(RAA-B3208)；恒溫核酸擴增儀(RAA-F1620)。

4.2 操作步驟

4.2.1 病毒核酸提取(具體操作見試劑盒說明書)

4.2.2 開啟熒光基因檢測儀，溫度調節至39 ℃

4.2.3 按反應體系配制表配制反應體系(單個樣品/反應)；混勻并離心；

4.2.4 將混合好的上述溶液加入到反應干粉管；向反應干粉管的蓋子上加入2.5 μl醋酸鎂；向上述溶液中加入2 μl樣本RNA，充分混勻并離心收集；

組分用量(μl)反應緩沖液25正向引物(10μmol/L)21反向引物(10μmol/L)21探針(10μmol/L)06雙蒸水157

4.2.5 將反應管放入熒光基因檢測儀反應30 min進行擴增，并實時觀察結果。反應程序：39 ℃，30 min；

5 結果分析

空白對照和陰性對照均無擴增曲線出現，陽性品有明顯的擴增曲線。

6 檢驗規則

需滿足以下質量控制要求，檢驗有效：空白對照陰性，陰性對照陰性，陽性對照陽性。

7 判定規則

從擴增曲線判斷，有明顯擴增曲線的樣品判定為EV71或者CA16陽性。

綜上所述，通過建立、驗證與確認方法，以及對“RT-RAA法檢測 EV71/ CA16等病毒”方法的實證研究，探索了病毒學實驗室基于實驗室資質認定條件下非標方法建立、確認、驗證、核查等一系列問題，同時嘗試將非標方法進行標準化改造，以拓展非標方法的使用范圍，提升其嚴謹性，為病毒學實驗室非標方法的確立與標準化提供了具體的實證樣本。

利益沖突：無

參考文獻

[1] 中華人民共和國認證認可條例(國務院令第666號).

[2] 檢驗檢測機構資質認定管理辦法(國家質量監督檢驗總局令第163號).

[3] 檢驗檢測機構資質認定評審準則(國認實[2016]33號).

[4] 關于實施《檢驗檢測機構資質認定管理辦法》若干意見(國認實[2015]49號).

[5] 中國合格評定國家認可委員會．檢測或校準實驗室能力認可準則[S].CNAS/CL01∶2006(等同于ISO/IEC17025).

[6] 中華人民共和國國家標準質量管理體系基礎和術語GB/T19000—2008/ISO9000—2005[M].北京：中國標準出版社.

[7] 通用計量術語及定義[S].JJF1001-1998.

[8] 武桂珍．《高致病性病原微生物危害評估指南》[M].北京：北京大學醫學出版社，2008．

[9] 中國合格評定國家認可委員會,實驗室認可準則在微生物實驗室應用說明[S].CNAS/CL09:2006.

[10] 中國合格評定國家認可委員會．實驗室認可準則在化學領域的應用說明[S].CNAS/CL09:2012．

[11] ISO/IEC指南99：方法確認—2007，2.45.

[12] ISO/IEC指南99：方法驗證—2007，2.44.

[13] 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所《質量手冊》,《程序文件》.

[14] 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所《作業指導書》.