狂犬病病毒抗體膠體金檢測試劑實際效能評價

呂書玉 趙方紅 張苗苗 劉宏乾

030002 太原，山西醫科大學臨床醫學二系(呂書玉)；050091 石家莊，河北華安生物醫藥股份有限公司(趙方紅，張苗苗，劉宏乾)

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus)引起的以中樞神經系統感染癥狀為主的傳染性疾病，病死率幾乎100%。人感染狂犬病病毒主要是由于被狂犬病病毒感染的動物，主要是犬、貓，咬傷或抓傷導致的。對于狂犬病暴露后處置(post-exposure prophylaxis, PEP)接種狂犬病疫苗必不可少。人體接種狂犬病疫苗后，機體可以產生狂犬病病毒中和抗體，狂犬病病毒中和抗體水平 ≥ 0.50 IU/ml 即可認為達到保護性抗體水平[1]。

檢測狂犬病病毒中和抗體水平的金標準是世界衛生組織推薦的小鼠腦內中和試驗(mouse neutralizing test, MNT)和快速熒光灶抑制試驗(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)[1]。MNT和RFFIT技術和操作難度較高，難以普及[2]。國內外目前主要應用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進行狂犬病病毒IgG抗體篩查[2-4]，應用膠體金(colloidal gold, CG)試劑進行狂犬病病毒IgG抗體篩查的報道資料極少。本研究探索CG試劑在狂犬病病毒IgG抗體篩查中的真實效能，為CG試劑的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1檢測樣品效價100 IU/ml的人狂犬病免疫球蛋白參考品由河北華安生物醫藥股份有限公司提供，以ddH2O制備1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500系列稀釋品。含100份狂犬病疫苗免疫者血清的血清盤由河北華安生物醫藥股份有限公司利用制備狂犬病免疫球蛋白的備用血漿制備并提供。

1.2主要試劑人狂犬病病毒抗體(IgG)檢測試劑盒(膠體金法)由國內某公司生產。細胞培養液(dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)為美國Life Technologies公司產品。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體FDI FUJIREBIO FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin為日本Fujirebio公司產品。

1.3狂犬病病毒抗體檢測

1.3.1 CG法:從密封袋中取出檢測卡，放在水平工作臺面上平置并做好樣本標記，取10 μl血清(狂犬免疫球蛋白稀釋品)直接加入到加樣孔中，再加入100 μl(約2～3滴)樣本稀釋液，15～20 min內判讀結果，20 min后檢測結果無效。C線和T線同時出現條帶判定為陽性結果，C線出現而T線不出現條帶判定為陰性結果，C線不出現條帶判定為無效檢測。每份樣品平行檢測2個CG試劑條，測定結果一致判斷為有效。

1.3.2 RFFIT法:按照文獻[5]中RFFIT操作方法進行，抗體效價 < 0.50 IU/ml判定為陰性結果，抗體效價 ≥ 0.50 IU/ml判定為陽性結果。每份血清平行檢測3次，取抗體效價幾何平均值(geometric mean titer, GMT)作為最終測定結果。

1.4統計學方法采用Excel表格整理數據，采用SPSS16.0統計學軟件進行統計學分析，CG法和RFFIT法檢出率的比較采用四格表卡方檢驗。

2 結果

2.1狂犬病免疫球蛋白系列稀釋品RFFIT、CG法比較以“稀釋度(RFFIT測定值，CG法檢測結果—陽性“+”、陰性“-”)”來表示不同稀釋度狂犬病免疫球蛋白稀釋品對應的RFFIT檢測值(IU/ml)和CG法檢測結果，依次為1∶5(19.62, +)、1∶10(9.53, +)、1∶15(6.53, -)、1∶20(5.21, -)、1∶25(3.68, -)、1∶30(3.02, -)、1∶35(3.00, -)、1∶40(2.36, -)、1∶45(2.12, -)、1∶50(1.86, -)、1∶55(1.66, -)、1∶100(0.96, -)、1∶200(0.52, -)、1∶300(0.30, -)、1∶400(0.22, -)、1∶500(0.16, -)。RFFIT測定值9.53 IU/ml(對應1∶10稀釋度)以下的各稀釋品在CG法中均測定為陰性結果。

2.2狂犬病疫苗免疫者血清RFFIT、CG法比較采用RFFIT和CG法對100份狂犬病疫苗免疫者血清進行檢測，RFFIT測定值 < 0.5 IU/ml的血清樣品26份，0.50 IU/ml ≤ RFFIT測定值 < 1.00 IU/ml的血清樣品18份，1.00 IU/ml ≤ RFFIT測定值 < 2.00 IU/ml的血清樣品24份，RFFIT測定值 ≥ 2.00 IU/ml的血清樣品32份。RFFIT測定值 < 2.00 IU/ml的血清樣品在CG法檢測中全部為陰性。RFFIT檢測值 ≥ 2.00 IU/ml的血清樣品在CG法檢測中有4份為陰性，這4份血清RFFIT測定值最高的為 2.80 IU/ml，其余血清樣品RFFIT測定值均 ≥ 3.30 IU/ml。

以RFFIT檢測結果為標準，CG法的特異性為100.00%(26/26)，假陽性率為0(0/26)；CG法的靈敏性為37.84%(28/74)，假陰性率為62.16%(46/74)。RFFIT陽性檢出率為74.00%(74/100)，CG法陽性檢出率為28%(28/100)，二者之間差異具有統計學意義(χ2=13.66,P=0.000)。見表1。

表1 快速熒光灶抑制試驗和膠體金法檢測狂犬病病毒抗體結果比較Tab.1 Comparision of the results of rabies virus antibodies tested by rapid fluorescent focus inhibition test and colloidal gold method

3 討論

我國是全球第二大狂犬病流行國家，每年PEP消耗人用狂犬病疫苗1 000～1 500萬人份[6]。檢測狂犬病疫苗接種者血清內狂犬病病毒抗體可以評價PEP的有效性，在某些情況下具有一定的現實意義[7]。CG法只能定性檢測狂犬病病毒抗體，操作便捷、不依賴實驗室，適合進行狂犬病病毒抗體初步篩查使用[4]。本研究顯示CG法對陽性血清有漏檢，對陰性血清無漏檢，也就是只有假陰性而沒有假陽性結果，出現假陰性結果的血清狂犬病病毒中和抗體效價不超過2.80 IU/ml。兒童、老年人、艾滋病患者等免疫力低下人群容易出現接種狂犬病疫苗后血清狂犬病病毒中和抗體水平較低的情況，對于此類人群要謹慎解讀CG法篩查時出現的陰性結果[8]。

本研究設立系列狂犬病免疫球蛋白稀釋品界定CG法檢測狂犬病病毒抗體的下限，即檢測靈敏性，結果顯示CG法檢測下限高于6.53 IU/ml 而低于9.53 IU/ml。然而，CG法檢測血清時顯示的檢測下限高于2.80 IU/ml但是低于3.30 IU/ml，這與狂犬病免疫球蛋白稀釋品界定CG法檢測下限差距明顯，這說明血清中除外狂犬病病毒中和抗體的某些其他成分對CG法檢測有未知影響，還有待深入研究其原因。同時，CG法檢測并未出現假陽性結果，說明血清中除外狂犬病病毒中和抗體的其他成分可能不會導致CG法檢測出現假陽性結果，值得后續增加樣品量作進一步研究。

ELISA法檢測血清狂犬病病毒抗體時假陽性和假陰性結果并存，通過改進包被抗原質量等手段可以提高ELISA法檢測狂犬病病毒抗體的效能，降低假陽性率和假陰性率[9-11]。影響狂犬病病毒抗體CG法試劑檢測靈敏性的主要因素是包被抗原的質量，改進包被抗原可以提高其檢測靈敏性，同時應注意是否會出現檢測假陽性的問題。我國《狂犬病暴露預防處置工作規范(2009年版)》明確MNT、RFFIT是個體進行狂犬病疫苗免疫后抗體檢測的標準方法[12]。應用CG法進行狂犬病病毒抗體篩查應當嚴格把握適用情況和科學解讀結果，必要時使用標準方法進行復核，這點應當給予足夠重視。

利益沖突:無

參考文獻

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[12] 衛生部. 狂犬病暴露預防處置工作規范(2009年版)[S]. http://www.moh.gov.cn/ mohbgt/ s10695/200912/45090.shtml