利用二代測序技術(shù)在不明原因發(fā)熱的血液樣本中檢測到人細環(huán)病毒

張益 蕪為 王佶 申辛欣 何小周 楊夢婕 馬學(xué)軍

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所中心實驗室

為便于研究長期發(fā)熱癥狀，Petersdorf[1]在1961年通過對100例患者前瞻性觀察，首次提出不明原因發(fā)熱(fever of unknown origin，F(xiàn)UO)的概念。隨著診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，不明原因發(fā)熱的概念也在不斷擴展，目前感染性疾病是FUO的最主要原因[2]，在20世紀90年代，20%～60%的FUO病屬于感染性疾病[3]。而進入21世紀后的10年內(nèi)，最主要的感染病原為細菌、病毒以及真菌和寄生蟲。近年來病毒感染比例呈明顯上升趨勢。然而傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測方法需要病原基因組序列的先驗知識，因此對于樣本中的未知病原需要有新的序列非依賴性的檢測手段來處理。

近些年來，隨著二代測序技術(shù)(NGS)的飛速發(fā)展，得益于二代測序通量的高速提升和成本的大幅下降，使得二代測序技術(shù)越來越廣泛的應(yīng)用于宏基因組檢測未知病原的研究領(lǐng)域中。相對于傳統(tǒng)的序列依賴性的核酸檢測技術(shù)，如PCR技術(shù)等，二代測序結(jié)合宏基因組技術(shù)具有不依賴于病原序列信息的特性，因此對臨床樣本的檢測使得我們能夠得到更加廣泛的病毒譜，進而也可以發(fā)現(xiàn)一些用傳統(tǒng)方法無法觀察到的病原組成情況[4]。

本研究中，對10份不明原因發(fā)熱癥狀的血液樣本進行宏基因組測序(metagenomics shotgun sequencing， MSS)時，發(fā)現(xiàn)了大量的人細環(huán)病毒(torquetenoVirus，TTV)相關(guān)序列。對這些序列進行組裝拼接并分析其進化樹后，發(fā)現(xiàn)其分屬于α TTV、β TTV和γ TTV三個屬。

1 材料與方法

1.1實驗材料與方法選取10份漢坦病毒IgG抗體檢測(ELISA)陰性的不明原因發(fā)熱的臨床血液樣本(均為出現(xiàn)發(fā)熱癥狀后一至兩周內(nèi)采集)，采用Qiagen 公司的RNease Mini Plus Kit試劑盒進行核酸提取。病毒基因組的反轉(zhuǎn)錄采用Invitrogen公司的Superscript Ⅲ試劑盒進行一鏈合成，隨后加入Klenow片段37 ℃孵育2 h進行二鏈合成。反轉(zhuǎn)后的cDNA采用REPLI-g WTA Single Cell Kit(Qiagen)試劑盒進行基于多重鏈置換反應(yīng)(multiple displacement amplification，MDA)的預(yù)富集。采用Thermalfisher公司的Ion Torrent Hi-Q試劑盒構(gòu)建測序文庫。以上步驟均按照相關(guān)廠商提供的標準流程進行。測序反應(yīng)在Ion Torrent PGM(Thermalfisher)平臺上完成。

1.2數(shù)據(jù)分析所有原始數(shù)據(jù)均為從Ion Torrent平臺下載的bam格式下機數(shù)據(jù)，應(yīng)用本地分析軟件Virus Identification Pipeline(VIP)進行分析[5]。

2 結(jié)果

2.1測序結(jié)果在10份樣本中均發(fā)現(xiàn)了不同程度的TTV感染，其中2號和6號樣本為單一性的α TTV感染；1號、5號和9號樣本為α TTV和γ TTV共感染；7號樣本為α TTV和β TTV共感染；3號、4號、8號和10號樣本為α TTV、β TTV和γ TTV共感染。α TTV、β TTV和γ TTV的感染率分別為100%、50%和70%(表1)。 在這10份樣本中，α TTV、β TTV和γ TTV3種TTV基因組覆蓋度達到70%以上的概率分別為：60%、30%和40%(表1)。 其中8號樣本病毒載量最高，α TTV、β TTV和γ TTV3種TTV基因組覆蓋度均達到99%以上，α TTV和γTTV的平均測序深度達到了400×以上(表1)。所有匹配讀長(Reads hit)在整個病毒基因組上的位置如圖1所示。

2.2進化分析用10份樣本中的測序reads組裝出的置信序列與從GenBank引用的TTV各型別的代表株以NJ法構(gòu)建序列進化發(fā)生樹。其中8號樣本的三種TTV序列進化樹分別見圖1。

3 討論

不明原因發(fā)熱(FUO)是常見的臨床綜合征，病因廣泛，有報道超過200種疾病能夠引起FUO。據(jù)統(tǒng)計，在1952-1994年間的FUO病例中，感染性疾病(占比28%)為主要病因，非感染性炎癥占比21%，惡性腫瘤占比17%，病因不明占比19%[2]。在非細菌感染樣本中，病毒感染呈明顯上升趨勢。但在無先驗經(jīng)驗的情況下，傳統(tǒng)免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)手段難以對樣本中的未知病毒病原進行鑒定。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新的病毒病原被發(fā)現(xiàn)。而這些新發(fā)現(xiàn)的病毒飛速的革新著我們關(guān)于病毒復(fù)雜程度的認知。越來越多的證據(jù)表明，這些新發(fā)現(xiàn)的病毒比傳統(tǒng)已知的病毒病原在臨床樣本中分布更為普遍。傳統(tǒng)意義上的病毒組(virome)的概念現(xiàn)在看來僅僅是構(gòu)成人體宿主宏微生物組的一部分[6]。盡管腸道微生物組的研究是當今的熱門，但是血液病毒組對于宿主免疫反應(yīng)和器官移植的安全依然有著極其重要的指示功能[7][8]。

表1 α TTV、β TTV和γ TTV在10份血液樣本中的測序數(shù)據(jù)

圖1 8號樣本中三種TTV(A:TTV, B:TTMV, C:TTMDV)一致性序列的進化分析(紅色圓點代表組裝出的一致性序列， 藍色方塊代表親緣關(guān)系最近的代表株)Fig.1 Phylogenetic analysis of TTV in 3 genera (A: TTV, B: TTMV, C:TTMDV) in sample 8 (red dot represent the assembled consensus sequence, blue square represent the closest reference)

近些年來，關(guān)于環(huán)狀、復(fù)制起始蛋白編碼的單鏈DNA病毒[circular，replication initiator protein(Rep)encoding，single-strand DNA virus，CRESS-DNA virus]的報道越來越多。這些病毒曾經(jīng)被認為只能感染植物或動物，但近10年的研究發(fā)現(xiàn)，該類病毒具有十分寬廣的宿主范圍，包括人在內(nèi)的脊椎動物到無脊椎動物均包含在內(nèi)[9]。這類病毒包括：Anellovirus；Circovirus；Cyclovirus；Gemycircularvirus；Gyrovirus；Smacovirus等[10-13]。這些病毒的病原學(xué)特性依然不清楚。而有報道稱Anellovirus能占到整個病毒組的70%左右[14]。在本研究中，核酸提取雖然采用的是RNA提取試劑盒，但也能夠采集到足量的病毒DNA，滿足檢測的需求。在本研究及類似的研究中[15],作為DNA病毒的TTV的核酸均由RNA提取試劑盒所提取。

人細環(huán)病毒(torque teno virus，TTV)最早于1997年在日本一例輸血后發(fā)生急性感染的非甲-戊型肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)[16]，被懷疑與肝炎相關(guān)。隨后TTMV(Torquetenominivirus，)與TTMDV(Torquetenomidivirus)分別于2000年和2007年[17]相繼被發(fā)現(xiàn)。隨后的研究表明，人TTV在世界范圍內(nèi)存在廣泛的分布[18- 19]。國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)將TTV歸類于一個新建立的科：指環(huán)病毒科(Anelloviridae)，目前該病毒科共包含9個病毒屬：α TTV(Alphatorquevirus)、β TTV(Betatorquevirus)、γ TTV(Gammatorquevirus)、δ TTV(Deltatorquevirus)、ε TTV(Epsilontorquevirus)、η TTV(Etatorquevirus)、ι TTV(Iotatorquevirus)、θ TTV(Thetatorquevirus)、ζ TTV(Zetatorquevirus)。目前國際病毒分類委員會主要以O(shè)RF1基因為基礎(chǔ)對TTV進行分類。以堿基序列35%的一致性為閾值來劃分以人為宿主的3個屬：Alphatorquevirusgenus(Torque teno virus，TTV)，Betatorquevirusgenus(Torque teno mini virus，TTMV)和Gammatorquevirusgenus(Torque teno midi virus，TTMDV)[15]。除此之外還有其他以各種動物為宿主的屬：豬細環(huán)病毒(Torquetenosusvirus， TTsuV)，貓細環(huán)病毒(Torque teno felis virus)，狗細環(huán)病毒(Torque teno canis virus)以及樹鼬細環(huán)病毒(Torque teno tupaia virus)[20]，近些年來，在嚙齒類以及蝙蝠中也發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的TTV。到目前為止，TTV被認為分為5個主要的進化簇，包含數(shù)10株準種。各準種間在ORF1上的堿基序列的差異超過35%[21]。在本研究中，二代測序產(chǎn)生的讀長在α TTV、β TTV和γ TTV3個屬中均有分布。其中α TTV感染率最高，在10份樣本中均有檢出，γ TTV和β TTV 排在其后，分別在7份和5份樣本中檢出。全部樣本中未發(fā)現(xiàn)其他屬TTV相關(guān)的測序讀長。而全部的10份樣本中，除1號樣本外，其余9份樣本的α TTV檢出水平高于β TTV和γ TTV。在β TTV和γ TTV之間，除了2號和6號樣本兩者均未檢出，7號樣本β TTV檢出高于γ TTV以外，其余7份樣本中γ TTV檢出均高于β TTV。

TTV基因組為單股負鏈環(huán)狀DNA，無包膜。基因組大小從2.86 ～2.91 kb(TTMV)、3.24～2.35 kb(TTMDV)到3.6～3.9 kb(TTV)不等，包含4個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，約2.6 kb，以及一個非編碼區(qū)(untranslated region， UTR)，約1.2 kb。不同TTV分離株之間編碼蛋白的氨基酸差異可以高達47%～70%[19, 22]。這種差異性分布并不均一，在編碼區(qū)明顯多于非編碼區(qū)。

對于TTV基因組如此高變的解釋是TTV擁有非常快的突變速率[22]，但有趣的是，作為一個DNA病毒、在缺乏自我復(fù)制機制、必須利用宿主具有高校準能力的DNA聚合酶系的情況下，依然擁有如此高的突變速率。合理的解釋是由于其單鏈的基因組結(jié)構(gòu)和編碼復(fù)制過程中涉及的蛋白的能力所致[23]。另一種解釋是僅有小部分TTV擁有完整的感染宿主細胞的原件，而大多數(shù)情況下感染宿主細胞是1個多準種的協(xié)同過程。也有報告稱Epstein-Barr virus(EBV)在TTV的感染過程中起到了協(xié)助的作用[24]。

TTV在世界范圍內(nèi)廣泛存在，但分布并不均一，報道過的在人群中的分布最低到5%[18]，最高達到90%[25]。與第一次被發(fā)現(xiàn)相似，TTV普遍存在于各類血液疾病、器官移植、腫瘤甚至牙周炎患者的體內(nèi)。在健康人群中同樣存在廣泛的分布[25]，并且這種分布隨年齡的增加而提高[26]。

TTV具有作為免疫標志物的巨大潛力，其廣泛的分布意味著TTV已經(jīng)建立起與宿主之間成功的互作關(guān)系。在一些采用PCR方法對TTV的病毒血癥進行長期監(jiān)控的研究中[27]，即便TTV陰性患者在免疫抑制狀態(tài)下也會變?yōu)殛栃浴Ｌ崾静《驹诮M織中比在外周血中有更高的免疫耐受。Kincaid等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，一種由TTV編碼的miRNA所介導(dǎo)的免疫逃逸機制，加上TTV在正常人群中的廣泛而均一的分布，使得TTV成為了一種免疫低下或免疫缺陷的標記。這種miRNA靶向作用于N-myc (and STAT) 的反應(yīng)原件(N-myc interactor，NMI)，由此產(chǎn)生對干擾素的干擾作用，并促使細胞增殖裂解。

由于缺乏合適的細胞系，TTV難于進行體外培養(yǎng)。同時缺乏相關(guān)的血清學(xué)方法來驗證病毒代謝產(chǎn)物與特異性的抗病毒免疫反應(yīng)。而TTV本身基因組高度的變異以及與宿主相互作用的復(fù)雜性，都使得TTV潛在的病原特性難以評估。因此，迄今為止尚未有明確的研究證據(jù)證明人細環(huán)病毒與任何臨床癥狀具有直接的關(guān)系。在本研究中，未檢測到明確致病病原可能由以下原因?qū)е拢阂皇窃谠絹碓蕉嗟膱蟮乐兴叨葢岩傻腡TV潛在的病原特性[15]；二是由于10份血液樣本均為出現(xiàn)發(fā)熱癥狀7～14 d內(nèi)所采集，而真正的致病病原的基因組序列信息有可能因為宿主已處于非急性期而含量偏低，導(dǎo)致在宿主血液中已經(jīng)難以檢測到，推測宿主免疫系統(tǒng)對發(fā)熱致病病原產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)和免疫應(yīng)答后，宿主免疫水平進入相對的受抑制或低下狀態(tài)。而在采樣時，宿主可能依然處于免疫受抑制或免疫水平低下狀態(tài)，從而導(dǎo)致TTV在血液中的檢出率升高。雖然TTV的病原學(xué)特性并不明確，這種現(xiàn)象提示TTV、宿主與致病病原三者間存在一定的相關(guān)性。另外，考慮到患者并未發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤或非感染性炎癥等癥狀，那么其他不明病因?qū)е碌陌l(fā)熱，以及由此而來的宿主免疫水平的下降，則可能導(dǎo)致潛伏的TTV在血液中的檢出率升高。

利益沖突:無

參考文獻

[1] Petersdorf RG, Beeson PB. Fever of unexplained origin: report on 100 cases[J]. Medicine (Baltimore) 1961, 40:1-30.

[2] Mourad O, Palda V, Detsky AS. A comprehensive evidence-based approach to fever of unknown origin[J]. Arch Intern Med，2003, 163(5):545-551. DOI:10.1001/archinte.163.5.545.

[3] Saltoglu N, Tasova Y, Midikli D, et al. Fever of unknown origin in Turkey: evaluation of 87 cases during a nine-year-period of study[J]. J Infect, 2004, 48(1):81-85.DOI:10.1016/j.jinf.2003.08.006.

[4] Goodwin S, McPherson JD, McCombie WR. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies[J]. Nat Rev Genet， 2016, 17(6):333-351.DOI:10.1038/nrg.2016.49.

[5] Li Y, Wang H, Nie K, et al. VIP: an integrated pipeline for metagenomics of virus identification and discovery[J]. Sci Rep, 2016, 6:23774.DOI:10.1038/srep23774.

[6] Virgin HW, Wherry EJ, Ahmed R.Redefining chronic viral infection[J]. Cell, 2009, 138(1):30-50.DOI:10.1016/j.cell.2009.06.036.

[7] Kapoor A, Kumar A, Simmonds P, et al.Virome Analysis of Transfusion Recipients Reveals a Novel Human Virus That Shares Genomic Features with Hepaciviruses and Pegiviruses[J]. MBio, 2015, 6(5):e01466-01415.DOI:10.1128/mBio.01466-15.

[8] Furuta RA, Sakamoto H, Kuroishi A, et al.Metagenomic profiling of the viromes of plasma collected from blood donors with elevated serum alanine aminotransferase levels[J]. Transfusion,2015, 55(8):1889-1899. DOI:10.1111/trf.13057.

[9] Rosario K, Duffy S, Breitbart M.A field guide to eukaryotic circular single-stranded DNA viruses: insights gained from metagenomics.[J] Arch Virol,2012, 157(10):1851-1871.DOI:10.1007/s00705-012-1391-y.

[10] Okamoto H.History of discoveries and pathogenicity of TT viruses[J]. Curr Top Microbiol Immunol,2009, 331:1-20.

[11] Phan TG, da Costa AC, Del Valle Mendoza J, et al.The fecal virome of South and Central American children with diarrhea includes small circular DNA viral genomes of unknown origin[J]. Arch Virol, 2016, 161(4):959-966. DOI:10.1007/s00705-016-2756-4.

[12] Tan le V, van Doorn HR, Nghia HD, et al. Identification of a new cyclovirus in cerebrospinal fluid of patients with acute central nervous system infections[J]. MBio,2013, 4(3):e00231-00213.DOI:10.1128/mBio.00231-13.

[13] Zhou C, Zhang S, Gong Q, et al. A novel gemycircularvirus in an unexplained case of child encephalitis[J]. Virol J, 2015, 12:197.DOI:10.1186/s12985-015-0431-0.

[14] De Vlaminck I, Khush KK, Strehl C, et al. Temporal response of the human virome to immunosuppression and antiviral therapy[J]. Cell, 2013, 155(5):1178-1187.DOI:10.1016/j.cell.2013.10.034.

[15] Mi Z, Yuan X, Pei G, et al.High-throughput sequencing exclusively identified a novel Torque teno virus genotype in serum of a patient with fatal fever[J]. Virol Sin,2014, 29(2):112-118.DOI:10.1007/s12250-014-3424-z.

[16] Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al.A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 241(1):92-97. DOI:10.1006/bbrc.1997.7765.

[17] Ninomiya M, Nishizawa T, Takahashi M, et al. Identification and genomic characterization of a novel human torque teno virus of 3.2 kb[J]. J Gen Virol,2007, 88(Pt 7):1939-1944.DOI:10.1099/vir.0.82895-0.

[18] de Oliveira JC, Nasser TF, Oda JM, et al.Detection of TTV in peripheral blood cells from patients with altered ALT and AST levels[J]. New Microbiol, 2008, 31(2):195-201.

[19] Luo K, He H, Liu Z, et al. Novel variants related to TT virus distributed widely in China[J]. J Med Virol, 2002, 67(1):118-126.DOI: 10.1002/jmv.2200.

[20] Lefkowitz EJ, Dempsey DM, Hendrickson RC, et al.Virus taxonomy: the database of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) [J]. Nucleic Acids Res, 2018, 46(D1):D708-D717.DOI:10.1093/nar/gkx932.

[21] Biagini P.Classification of TTV and related viruses (anelloviruses) [J]. Curr Top Microbiol Immunol. 2009, 331:21-33.

[22] Biagini P, Gallian P, Attoui H, et al. Determination and phylogenetic analysis of partial sequences from TT virus isolates[J]. J Gen Virol, 1999, 80 (Pt 2):419-424.DOI:10.1099/0022-1317-80-2-419.

[23] Shackelton LA, Parrish CR, Holmes EC.Evolutionary basis of codon usage and nucleotide composition bias in vertebrate DNA viruses[J]. J Mol Evol,2006, 62(5):551-563.DOI:10.1007/s00239-005-0221-1.

[24] Borkosky SS, Whitley C, Kopp-Schneider A, et al. Epstein-Barr virus stimulates torque teno virus replication: a possible relationship to multiple sclerosis[J]. PLoS One, 2012, 7(2):e32160.DOI:10.1371/journal.pone.0032160.

[25] Vasilyev EV, Trofimov DY, Tonevitsky AG, et al. Torque Teno Virus (TTV) distribution in healthy Russian population[J]. Virol J, 2009, 6:134.DOI:10.1186/1743-422X-6-134.

[26] Saback FL, Gomes SA, de Paula VS, et al. Age-specific prevalence and transmission of TT virus[J]. J Med Virol,1999, 59(3):318-322.DOI:10.1109/TPS.2004.828780.

[27] Gorzer I, Jaksch P, Kundi M, et al. Pre-transplant plasma Torque Teno virus load and increase dynamics after lung transplantation[J]. PLoS One,2015, 10(3):e0122975.DOI:10.1371/journal.pone.0122975.

[28] Kincaid RP, Burke JM, Cox JC, et al. A human torque teno virus encodes a microRNA that inhibits interferon signaling[J]. PLoS Pathog, 2013, 9(12):e1003818.DOI:10.1371/journal.ppat.1003818.