肉桂醛對呼吸道合胞病毒感染宿主HeLa細胞Caspase-9和p-AKT表達的影響

衛 高 代立娟 宋英杰

(佳木斯大學研究生部，黑龍江 佳木斯 154007)

呼吸道合胞病毒〔1,2〕感染后，若不及時處理易并發呼吸衰竭危及生命。而可選的抗病毒藥物較少，且這些藥物不僅過于廣譜，有的不良反應明顯。肉桂醛〔3〕是一種較好的抗病毒中藥，有實驗已證明它在凋亡通路上有較好的抗病毒作用〔4〕，但機制不清。本實驗從促凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-9)和抑凋亡蛋白磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)表達方面探討其原理。

1 材料與方法

1.1材料 呼吸道合胞病毒，Hela細胞株由佳木斯大學基礎醫學實驗室保存。肉桂醛、1640培養液、胎牛血清分別購買于美國Sigma 公司、Invitrogen 公司、浙江天杭生物科技股份有限公司。兔抗Caspase-9多克隆抗體北京百奧萊博科技有限公司，p-AKT蛋白多克隆抗體上海鈺博生物科技有限公司。

1.2細胞培養 準備培養箱,其內溫度為37℃、CO2濃度為5%。準備10%的細胞培養液，置于培養瓶中；把預備好的Hela 細胞接種到培養瓶中。將處理好的培養瓶(培養瓶1 d更換1次培養液)放到準備好的培養箱中,多次觀察細胞生長，觀察到細胞生長大于80%時停止,胰酶消化后進行傳代培養，培養細胞到需要量停止。

1.3病毒液制備收集 細胞培養應當每日觀察,當觀察到細胞達70%后，接種準備好的呼吸道合胞病毒液，后繼續培養,當發生病變到75%時，經過3凍3融(溫度為-80℃，37℃)收集后，收集病毒液置于低溫冰箱保存以備用。

1.4肉桂醛配制 準備2%細胞維持液稀釋肉桂醛到需要濃度,準備濾器將其過濾以備用。

1.5接種病毒毒力測定 Hela細胞接種96孔板，待細胞長成單層，將已經稀釋好的不同濃度的病毒液置于孔板中，每一個濃度重復8孔，后置于培養箱中培養，設陰性對照組和正常細胞組，顯微鏡多次觀察細胞形態，根據細胞變性效果(CPE) 結果變化用Reed-Muench法計算細胞半數感染量(CCID50)，本實驗中100CCID50/100 μl為病毒攻擊量。直接滅活階段、生物合成階段、病毒吸附階段、藥物預處理作用，4個階段均用這個病毒100CCID50/100 μl呼吸道合胞病毒液。

1.6肉桂醛對Hela細胞毒性測定

1.6.1對呼吸道合肥病毒的直接滅活作用 將Hela細胞接種至放有蓋玻片經多聚賴氨酸處理的8孔板中，當其長成約70%備用，將低(0.007 810 mg/mg)、中(0.015 63 mg/mg)、高濃度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛與病毒液等量混勻，置37℃溫箱2 h后，將其接種在Hela細胞已長成單層的96孔細胞培養板中，37℃下培養吸附2 h后，棄上清，加維持液，每一濃度設8個復孔，實驗同時設病毒組、正常細胞組作為對照，置于5%CO2、37℃孵箱培養。每日多次觀察CPE，Western印跡測定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表達情況。

1.6.2對呼吸道合肥病毒的吸附作用 將Hela細胞接種至放有蓋玻片經多聚賴氨酸處理的8孔板中長成約70%備用，將低(0.007 810 mg/mg)、中(0.015 63 mg/mg)、高濃度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛與病毒液等量混勻，棄8孔板中培養液。每孔加入不同濃度的肉桂醛與病毒的混合液，設病毒組、正常細胞組作為對照，置37℃溫箱2 h，后棄混合液病毒液，加入2%細胞維持液，每日多次觀察CPE，Western印跡測定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表達情況,作記錄。

1.6.3生物合成階段 將Hela細胞接種至放有蓋玻片經多聚賴氨酸處理的96孔板中長成約70%備用，將低(0.007 810 mg/mg )、中(0.015 63 mg/mg)、高濃度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛與病毒液等量混勻，置37℃溫箱2 h。棄8孔板中培養液。每孔加入不同濃度肉桂醛與病毒的混合液，設病毒組、正常細胞組作為對照，置37℃溫箱2 h，棄混合液病毒液，加入細胞維持液，每日多次觀察CPE，Western印跡測定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表達情況,作記錄。

1.6.4對細胞的保護作用 將Hela細胞接種至放有蓋玻片經多聚賴氨酸處理的96孔板中長成約70%備用，將低(0.007 810 mg/mg)、中(0.015 63 mg/mg)、高濃度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛與其等量混勻，置37℃溫箱2 h。棄8孔板中培養液。每孔加入不同濃度的肉桂醛與病毒混合液，設病毒組、正常細胞組作為對照置37℃溫箱2 h，棄混合液病毒液。每孔加入病毒液，每日多次觀察CPE，Western印跡測定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表達情況,作記錄。

1.7統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行方差分析、LSD檢驗。

2 結 果

肉桂醛在0.078 10～0.031 25 mg/ml之間有效且無毒。一定范圍內肉桂醛濃度降低呼吸道合肥病毒毒性。呼吸道合胞病毒毒力在病毒組細胞病變達到75%時，電鏡下觀察，細胞形態學變化大于50%即CPE 陽性。用Reed-Muench法計算得CCID50為106.65，本實驗中100CCID50/100 μl 病毒攻擊量為104.65。與正常細胞組相比，病毒組Caspase-9蛋白表達明顯升高、p-AKT蛋白表達明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。經藥物干預后與病毒組相比，細胞Caspase-9蛋白表達明顯下降，且高濃度組下降最多，其次為中濃度，低濃度下降最少(均P<0.01)。細胞p-AKT蛋白表達明顯增加，且高濃度組增加最多，其次為中濃度，低濃度增加最少(均P<0.01)。見表1。

表1 Hela細胞在不同作用方式下Caspase-9、p-AKT蛋白表達情況

與正常細胞組比較：1)P<0.01；與病毒組比較：2)P<0.01

3 討 論

細胞凋亡是當代研究的熱點，其途徑眾多〔5～8〕。目前已知外源性通路(死亡受體途徑)，內源性通路(線粒體途徑)和內質網通路〔9〕三條經典的通路，線粒體途徑是其一，而活化的Caspase-9是線粒體途徑中較為上游的分子，它能夠激活其他下游Caspase蛋白(主要為Caspase-3)，引起細胞凋亡。在經典通路之外,還存在其他凋亡相關的通路p-AKT信號通路就是其中之一，它能夠抑制凋亡，p-AKT是次通路上游且重要的分子，能夠抑制下游分子,進而抑制凋亡向下進行。呼吸道合胞病毒感染HeLa細胞后,能夠引起HeLa細胞凋亡,但具體機制不明,本實驗說明肉桂醛的抗呼吸道合肥病毒與凋亡相關蛋白Caspase-9和p-AKT表達有一定關系，但凋亡通路復雜，具體促凋亡及抑凋亡機制還需進一步研究。

4 參考文獻

1代立娟,韓有文,李紹民,等.肉桂醛對RSV宿主細胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2014；34(6):1575-7.

2劉 蕾,劉志新,王淑湘,等.翻白草油對RSV感染宿主HeLa細胞Fas/FasL蛋白表達的影響〔J〕.中國病原生物學雜志,2014；9(5):403-7.

3劉愛華,陳洪忠.肉桂揮發油——β-環糊精包結物的研究〔J〕.山東醫藥工業,1997；(4)：3-4.

4代立娟,王 琳,馮 瀾.肉桂醛抗呼吸道合胞病毒的作用〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(6):1309-12.

5劉江濤,郭 雄,吳翠艷,等.線粒體細胞色素c介導的caspase-9激活通路參與大骨節病關節軟骨細胞凋亡的發生機制〔J〕.西安交通大學學報(醫學版),2011;32(5):580-8.

6程新燕,符翠莉.芹菜素對大鼠骨肉瘤細胞凋亡及相關蛋白Bax,Bcl-2,Caspase-3,Caspase-9,細胞色素C的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2016；22(15):139-42.

7張鳳梅,李洪源,李 霞,等.敗醬草多糖體外抗呼吸道合胞病毒作用的研究〔J〕.黑龍江醫藥科學,2006；29(1):48-50.

8朱鐵銳,馮海軍,孫 琳.病毒唑霧化吸入治療嬰幼兒呼吸道合胞病毒所致流行性喘憋性肺炎療效觀察〔J〕.黑龍江醫藥科學,1999;22(4):48.

9趙彥超,顧 耘.細胞凋亡通路研究進展〔J〕.現代醫學,2013；41(4):285-8.