醛固酮受體拮抗劑聯(lián)合貝那普利對阿霉素腎病大鼠腎組織nephrin、WT1表達(dá)的影響

史亞男 王利軍 胡志娟 馮 珍 牛 凱

(河北省人民醫(yī)院腎內(nèi)科,河北 石家莊 050051)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)與腎臟疾病聯(lián)系密切。對于RAS的有效抑制是腎臟疾病治療的重要途徑。目前已證實血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)可降低腎病患者尿蛋白水平，延緩腎臟疾病進(jìn)展，但長期應(yīng)用，部分患者會發(fā)生醛固酮逃逸現(xiàn)象，且ACEI并不能完全阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)。微小病變腎病是腎病綜合征常見病理類型，部分患者存在反復(fù)復(fù)發(fā)、激素依賴及激素抵抗等情況，臨床表現(xiàn)為難治性腎病。阿霉素腎病大鼠腎臟病理改變與微小病變相似，均主要表現(xiàn)為腎小球上皮細(xì)胞足突融合。本實驗觀察阿霉素腎病大鼠腎組織nephrin和WT1表達(dá)變化，探討醛固酮受體拮抗劑及貝那普利對其影響及nephrin和WT1與尿蛋白的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實驗分組、動物模型建立及腎組織取材 體重200～220 g的雄性SD大鼠60只(河北實驗動物研究中心提供)，分為正常對照(A組)、阿霉素腎病(B組)、貝那普利干預(yù)(C組)及醛固酮受體拮抗劑聯(lián)合貝那普利干預(yù)(D組)各15只。B、C、D 3組一次性給予尾靜脈注射阿霉素(10 mg/kg)，建立腎病模型；A組一次性給予尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉；C組給予貝那普利10 mg·kg-1·d-1灌胃，1次/d；D組給予螺內(nèi)酯40 mg·kg-1·d-1及貝那普利10 mg·kg-1·d-1灌胃，1次/d；A與B組僅給予等量自來水灌胃。建立模型第6周時所有大鼠測定24 h尿蛋白；腹主動脈取血，測定血清肌酐、白蛋白。部分腎組織甲醛固定后石蠟包埋；剩余腎組織以液氮冷凍后，-80℃保存。

1.2常規(guī)病理學(xué)觀察 4%多聚甲醛固定腎組織，24 h后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟并石蠟包埋，切片厚2 μm，行蘇木素-伊紅(HE)、過碘酸雪夫染色(PAS)、腎組織六胺銀染色(PASM)和Masson染色，光鏡觀察。每張切片在400倍物鏡下至少取10個完整腎小球。戊二醛、鋨酸雙重固定腎組織后乙醇、丙酮梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋后LKB-V超薄切片，并行鈾-鉛雙重染色，最后JOEL-1200EX透射電鏡觀察并攝片。

1.3RT-PCR測定大鼠腎組織nephrin和WT1的表達(dá) Trizol一步法提取組織總RNA，取5 μg組織總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，nephrin擴(kuò)增片段長度371 bp。WT1擴(kuò)增片段長度162 bp。β-actin擴(kuò)增片段長度302 bp。nephrin上游引物5′GCCTGAGGTCCAGTGTGAGGA3′,下游引物5′TCATCCCCAGGCTTGGAACA3′;WT1上游引物5′TGTGTGCTTAAACTGCTTCCAA3′,下游引物5′TTAATCAAGAGTGGGCAGAGA-CC3′;β-actin上游引物5′TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA3′,下游引物5′TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3′。2%配制瓊脂糖凝膠，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果用BIO-PROFIL凝膠成像分析系統(tǒng)分析，nephrin及WT1 mRNA相對含量分別用與β-actin吸光度×面積的比值表示。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行齊性檢驗、單因素方差分析、q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠尿與血生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較 與A組相比，B組白蛋白顯著降低，血肌酐、24 h尿蛋白含量顯著升高(均P<0.01)；與B組比較，C、D組白蛋白顯著升高，血肌酐、24 h尿蛋白顯著下降(均P<0.01)。見表1。

表1 各組白蛋白、血肌酐、24 h尿蛋白的比較

與A組比較：1)P<0.01；與B組比較：2)P<0.01

2.2病理組織學(xué)改變 光鏡檢查：與A組比較，B組大鼠腎組織出現(xiàn)包括部分腎小球局灶節(jié)段硬化、間質(zhì)灶狀纖維化及腎小管空泡顆粒樣變性等改變。而C、D組上述腎臟病理改變明顯改善，以D組效果明顯。見圖1。電鏡檢查：與A組比較，B組部分腎小球上皮細(xì)胞足突融合，間質(zhì)灶狀纖維化及腎小管空泡顆粒變性， C、D組變化較B組明顯減輕。見圖2。

圖1 各組大鼠腎組織PAS染色結(jié)果(×200)

圖2 各組大鼠腎組織電鏡檢查結(jié)果(×200)

2.3各組腎皮質(zhì)nephrin和WT1表達(dá)水平比較 與A組相比，B組大鼠腎組織nephrin、WT1表達(dá)明顯降低(P<0.01)；C組、D組nephrin、WT1 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05，P<0.01)。 見圖3、表2。

圖3 各組nephrin、WT1 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果

表2 各組大鼠腎組織nephrin及WT1 mRNA相對半定量分析

與A組比較：1)P<0.01；與B組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

3 討 論

微小病變腎病臨床發(fā)生率高，老年及兒童多發(fā)，臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥，可伴有腎功能受損。實驗證實腎小球足細(xì)胞病變是導(dǎo)致腎病蛋白尿的重要因素〔1〕，研究表明足細(xì)胞所表達(dá)的足細(xì)胞相關(guān)分子對于維持足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能起重要作用〔2〕，其中nephrin是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多，也是最重要的足細(xì)胞分子之一。已有實驗證實編碼nephrin分子的基因表達(dá)異常可見于多種尿蛋白排泄率增高的先天及后天獲得性腎臟疾病。研究顯示伴有蛋白尿的腎病患者腎組織nephrin表達(dá)水平下降〔3～5〕。WT1是一種抑癌基因，作用于足細(xì)胞特異性基因NPHS1，對維持正常的足細(xì)胞功能十分重要〔6〕。本研究顯示，阿霉素腎病大鼠腎組織nephrin和WT1表達(dá)水平下降明顯，推測其尿蛋白的發(fā)生與nephrin和WT1的表達(dá)改變有關(guān)。RAS激活在腎臟疾病中起重要的作用。研究表明，ACEI及醛固酮受體拮抗劑可降低腎病患者的尿蛋白水平，但具體機(jī)制不清〔7〕。本實驗觀察到阿霉素腎病大鼠應(yīng)用貝那普利及醛固酮受體拮抗劑后，尿蛋白明顯減少，同時腎組織nephrin和WT1表達(dá)增強，推測二者可能通過上調(diào)nephrin和WT1的表達(dá)，改善腎病大鼠腎小球足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能，從而降低尿蛋白，二者作用協(xié)同。

4 參考文獻(xiàn)

1Tesar V,Zima T,Kalousova M.Pathobiochemistry of nephrotic syndrome〔J〕.Adv Clin Chem，2003;37:173-218.

2Palmen T,Lehtonen S, Ora A,etal. Interaction of endogenous nephrin and CD2-associated protein in mouse epithelial M-1 cell line〔J〕. J Am Soc Nephrol,2002;13(7): 1766-72.

3Lahdenpera J,Kilpelainen P,Liu XL,etal. Clustering-induced tyrosine phosphorylation of nephrin by Src family kinases〔J〕. Kidney Int, 2003;64(4):404-13.

4Wang SX,Mene P,Holthofer H.Nephrin mRNA regulation by protein kinase C〔J〕.J Am Nephrol,2001;14(2):98-103.

5Huber TB,Kottgen M,Schilling B,etal.Interaction with podocin facilitates nephrin signaling〔J〕.J Biol Chem,2001;276(45): 41543-6.

6Srichai MB,Konieczkowski M,Padiyar A,etal.A WT1 co-regulator controls podocyte phonotype by shutting between adhesion structures and nucleus〔J〕.J Biol Chem,2004;279(14)：14398-408.

7Carey RM,Siragy HM.The intrarenal rennin-angiotensin system and diabetic nephropathy〔J〕.Trends Endocrinol Metab,2003;14(6):274-81.