L-NMMA對阿爾茨海默病模型大鼠海馬齒狀回區谷氨酸含量的影響

王瑋瑤 占素揚 孫傳博 趙 可 金清華

(延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研室，吉林 延吉 133002)

阿爾茨海默病(AD)患者海馬會出現以齒狀回區(DG)體積明顯縮小、神經元密度明顯降低、樹突長度明顯變短為主要特征的病理學改變；在AD模型鼠中，海馬DG也會出現類似的如神經元突觸后致密帶厚度變薄、突觸間隙增寬、突觸界面曲率降低等形態學改變〔1〕。L-單甲基-精氨酸(L-NMMA)屬于氨基酸類非選擇性一氧化氮(NO)合成酶(NOS)抑制劑，可以有效抑制NOS活性，對NO的生成有較強且全面的抑制作用。NO是細胞與細胞之間信息傳遞的重要的調節因子，對海馬學習記憶的調解中起重要作用，NO可以通過激活鳥苷酸環化酶(GC)進而促進谷氨酸(Glu)的釋放，促進學習記憶過程。有研究指出Glu能系統和NO系統的異常可能是造成AD學習記憶功能障礙的因素之一〔2，3〕。本實驗通過觀察L-NMMA對AD模型大鼠的海馬DG區Glu含量及空間學習記憶能力的影響，探討AD大鼠模型中NO對學習記憶的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1動物模型的制備 18只成年雌性SD大鼠，體重(270±30)g，隨機分成3組：假手術組(sham)、AD模型(AD)組和AD+L-NMMA(L-NMMA)組，每組6只。采用雙側卵巢摘除加D-半乳糖腹腔注射的方法來制備AD模型大鼠，方法如下：大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)進行麻醉，待大鼠深度麻醉后固定在手術臺上，大鼠取仰臥位。在臍與恥骨前緣的中點處，向后沿著腹底壁的正中線，切開2～3 cm的切口，摘除雙側卵巢。手術后第2天開始，每天對大鼠腹腔注射D-半乳糖(60 mg/kg)，持續6 w。sham組大鼠也進行開腹術，但是找到卵巢之后不進行摘除，術后第2天開始，每天進行腹腔注射生理鹽水，持續6 w。

1.2海馬DG微量透析探針的埋入及Glu含量的測定 AD模型制備成功后的第2天，將大鼠麻醉固定于腦立體定位儀上，將透析所用的外套管，插入到DG上的0.1 cm處(定位坐標為：前囟向后退0.34 cm，正中線旁開距離為0.22 cm，深度為0.25 cm)，用牙科水泥將外套管固定在大鼠顱骨表面。將自制的微量透析探針經過外套管，垂直插入大鼠海馬DG，并與外套管固定牢靠。探針前端超出套管的長度為0.1 cm，其前端的乙酸纖維素半透膜外徑為0.02 cm，分子量小于50 000 D的物質可被濾過，將微量注射所用的玻璃微管，通過連接頭，固定于探針表面到達DG。在大鼠手術恢復1 d之后，將微量透析探針與微量泵相連接(ESP-64，日本Eicom公司)向透析探針內注入人工腦脊液灌流(147 mmol/L NaCl，4 mmol/L KCl，2.3 mmol/L CaCl2，pH6.5；1.5 μl/min)，連接大鼠穩定30 min后開始收集微量透析樣本，每只動物收集3個管，每管樣本收集10 min。透析樣本的第一次收集結束之后，開始進行為期5 d的Morris水迷宮試驗(MWM)，并在每天訓練結束后按上述方法對動物進行微量透析。進行高效液相色譜分析時，將3 μl OPA(4 mmol/L)誘導劑與12 μl樣本在室溫下充分混合，反應2.5 min后抽取10 μl反應液，用微量注射針將反應液推入生物活性物質微量分析系統 (HTEC-300，日本Eicom公司)中，然后再通過其高效液相色譜分離柱、電化學檢測器，得到樣本中Glu的含量。

1.3MWM實驗 應用MWM(上海吉量)對大鼠空間學習記憶能力進行檢測。此部分實驗包括定位航行實驗(4 d)和空間探索實驗(1 d)。在訓練的前4 d，每天將大鼠分別從不同入水點放入水池，如果大鼠在規定時限(120 s)內能夠找到并爬上站臺，則其逃避潛伏期為自入水后到爬上站臺為止所用時間；若不能則其逃避潛伏期計為120 s。在第5天的空間探索試驗中，撤去隱藏站臺后將大鼠從同一入水點放入水池，記錄大鼠在120 s內穿越原站臺區的次數。

1.4DG區微量注射藥物 非選擇性NOS抑制劑L-NMMA(美國Sigma公司)用改良Riger液配成1 μg/μl的溶液，-4℃保存。每天進行MWM訓練之前以1 μl/min的速度向海馬DG注射L-NMMA(L-NMMA組)或改良Riger液(sham組或AD組)，注入時程為1 min，30 min后開始進行MWM訓練。

1.5統計學方法 采用Prism3.0軟件進行t檢驗或單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組海馬DG Glu水平比較 與sham組〔(1.80±0.58)μmol/L〕比較，AD組大鼠海馬DG的細胞外液中Glu的基礎含量〔(1.63±0.79)μmol/L〕差異無統計學意義(P>0.05)，L-NMMA組Glu含量〔(2.23±0.72)μmol/L〕較AD組有增高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2各組空間學習能力比較 隨著訓練天數的增加，除AD組第2天差異無統計學意義外，3組大鼠逃避潛伏期均逐漸顯著減小(P<0.05)。第2～4天，AD組逃避潛伏期明顯大于sham組(P<0.05)；L-NMMA組逃避潛伏期明顯低于AD組(P<0.05)。見表1。

表1 各組逃避潛伏期比較

與第1天相比： 1)P<0.05；與sham組相比：2)P<0.05；與AD組相比:3)P<0.05

2.3各組空間記憶能力比較 AD組〔(3.67±0.82)次/120 s〕和L-NMMA組〔(7.83±1.47)次/120 s〕穿越原站臺區的次數明顯少于sham組〔(11.17±1.17)次/120 s，均P<0.05〕，L-NMMA組穿越原站臺區的次數明顯高于AD組(P<0.05)。

2.4各組Glu含量變化比較 與訓練前比較，除第1天差異無統計學意義外AD組Glu含量隨訓練天數的增加而逐漸顯著增加(均P<0.05)，L-NMMA組Glu含量和sham組的變化趨勢一樣，均隨訓練天數的增加Glu含量呈先增加后又降低的趨勢，而且與訓練前比較，sham組和L-NMMA 組Glu含量在訓練的第2、3天時均明顯增高(P<0.05)。與AD組比較，L-NMMA組第4、5天Glu含量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組Glu含量變化比較

與訓練前相比:1)P<0.05；與AD組相比：2)P<0.05

3 討 論

認知功能障礙是AD最主要的臨床表現之一，而大腦中負責認知功能的基礎部位是海馬，同時，海馬也是中樞神經系統中負責學習記憶的關鍵結構。NO是中樞神經系統中重要的氣體型神經遞質，海馬中的NO對學習和記憶功能具有促進作用〔4，5〕。抑制NO系統可有效改善認知記憶的受損〔6〕，也可以減弱離體培養的神經元的退行性改變〔2〕，在AD大鼠腦內NOS的水平明顯降低〔3〕，而激活NO系統后老齡大鼠的學習記憶得到明顯改善〔7〕。本實驗結果表明在訓練前給AD模型大鼠微量注射L-NMMA后，明顯改善AD大鼠空間學習記憶障礙，AD大鼠海馬DG區內NO可損害空間學習和記憶功能，這與正常大鼠狀況相反。AD學習和記憶受損的重要原因之一是興奮性氨基酸-Glu的神經毒性作用，其機制可能是Glu過度活化膜上的NMDA受體，激活突觸內的Ca2+通道使Ca2+大量釋放，導致神經元、少突膠質細胞中毒〔8〕。海馬DG區內的NO可以作為逆行信使通過增加局部的Glu水平來促進主動回避學習記憶過程〔9〕。本實驗結果提示Glu在局部大量積聚而影響DG區正常的突觸傳遞，對大鼠學習記憶功能產生影響。本實驗結果顯示AD大鼠的學習記憶損傷可能與海馬內NO促進了氨基酸類神經遞質Glu的過度生成而影響了突觸的正常傳遞有關，其機制還需進一步研究。

4 參考文獻

1姜 霞.空間學習對AD模型鼠海馬突觸可塑性及神經發生的影響〔D〕.武漢：華中科技大學，2012.

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4Harooni HE，Naghdi N，Sepehri H，etal.The role of hippocampal nitric oxide (NO) on learning and immediate，short-and long-term memory retrieval in inhibitory avoidance task in male adult rats〔J〕.Behav Brain Res，2009；201(1)：166-72.

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9Wang S，Pan DX，Wang D，etal.Nitric oxide facilitates active avoidance learning via enhancement of glutamate levels in the hippocampal dentate gyrus〔J〕.Behav Brain Res，2014；271：177-83.