臺州市本地感染登革病毒分子分型及溯源分析

王東紅 裘丹紅 翁堅 盛瑩 林海江 林春萍 孔超 周靜曉 沈偉偉

318000 臺州市疾病預(yù)防控制中心(王東紅、裘丹紅、翁堅、盛瑩、林海江、沈偉偉)；318020 臺州市黃巖區(qū)疾病預(yù)防控制中心(林春萍、孔超、周靜曉)

登革病毒(dengue virus, DENV)是單股正鏈RNA病毒，含有一個長的開放讀碼框，編碼7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2A、NS2B、NS1、NS3、NS4B、NS4A和NS5)和3種結(jié)構(gòu)蛋白(E、C和prM)[1]。基因組全長約11 kb，其中E基因全長1 485 bp，編碼E蛋白相對分子質(zhì)量54.5×103，E蛋白是重要的抗原成份，與受體識別有關(guān)。E基因區(qū)域的重組對病毒的適應(yīng)性及進化具有潛在意義，也是登革病毒分型的依據(jù)[2-3]。

本研究針對2016年10月在浙江省臺州市黃巖區(qū)暴發(fā)的3例登革熱病例進行研究。這3例患者經(jīng)實驗室診斷為I型登革病毒感染，采集患者急性期血清分別進行了NS1抗原檢測、IgM、IgG抗體和核酸檢測；用白蚊伊蚊細(xì)胞(C6/36)分離培養(yǎng)，PCR擴增3株病毒的E基因序列并與NCBI中已公布的基因序列進行比對并進行進化分析，探討其輸入來源與基因型別。

1 材料與方法

1.1材料登革患者急性期血清。登革熱NS1快速檢測試劑、登革熱IgM/IgG快速檢測卡購自深圳市科潤達生物工程有限公司、磁珠法提取RNA試劑盒(life technology: Amb18365)、DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、谷氨酰胺、青鏈霉素、胎牛血清購自杭州昊天生物技術(shù)有限公司；C6/36細(xì)胞由本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1 血清學(xué)檢測：應(yīng)用登革熱NS1快速檢測試劑、登革熱IgM/IgG快速檢測卡對采集的血清進行檢測，檢測操作和實驗結(jié)果判斷參照試劑說明書。

1.2.2 病毒分離：將患者急性期血清，按照1∶10稀釋，取100 μl接種到長成單層的C6/36細(xì)胞分離培養(yǎng)。28℃吸附1 h，棄掉上清，加入含有1%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第二天開始觀察細(xì)胞病變情況，一般需要培養(yǎng)7 d才能觀察到細(xì)胞病變，如果沒有病變，則盲傳3代接種細(xì)胞，盲傳3代無細(xì)胞病變則為陰性。

1.2.3 登革病毒型別鑒定：取100 μl病毒分離培養(yǎng)液，采用磁珠法提取病毒RNA，操作步驟見說明書。引物采用通用和特異性熒光對登革病毒進行型別鑒定。引物序列和反應(yīng)條件參考登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 216-2008)。

1.2.4 E基因序列測定：E基因擴增引物參考文獻[4]，F(xiàn)1: 5′-GCTTTGCGACACCCAGGATTC-3′；R1: 5′-GCACEAGTCAACGCAGTG-3′；F2: 5′-GCAAAGAAGCAGGAAGTAGTCGTA-3′；R2: 5′-TGCTGATAGTCTTTTTGGGGAGTC -3′。引物由北京六合華大基因有限公司合成。用一步法RT-PCR對提取的病毒RNA進行擴增，擴增條件為：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，45個循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。擴增的全長E基因片段經(jīng)純化，送北京六合華大基因有限公司測定。

1.2.5 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建：測得的E基因片段采用Seqman(7.1.0)軟件進行拼接。用BLAST分析其一致性最高的基因序列來源，用MEGA6.0軟件采用相鄰連接法(Neighbor-Joining Method)對E 基因序列進行進化分析。從GenBank查找24株DENV-I國內(nèi)外流行株和參考株的E基因序列進行進化分析[5]，以DENV-3作為樹外對照株(GenBank ID: AY744678)。

2 結(jié)果

2.1病毒分離用C6/36細(xì)胞對3例登革病毒急性期血清進行病毒分離培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞出現(xiàn)融合，空泡、腫脹、細(xì)胞壞死和脫落等細(xì)胞病變現(xiàn)象。共分離出3株登革病毒。細(xì)胞接種病毒前(圖1 A)和接種病毒5 d后(圖1B)的狀態(tài)見圖1。

A,接種前；B,接種后5 d
圖1 患者血清標(biāo)本接種C6/36細(xì)胞后出現(xiàn)細(xì)胞病變
A,Before incoulation;B,5 d after inoculation
Fig.1 Cytopathic effects of C6/36 cell lines caused by inoculation of serum samples from patients

2.2患者基本信息及登革病毒特異檢測結(jié)果通過熒光RT-PCR對登革病毒進行分型，所有的登革病毒均為DENV-I型。對3例登革病例進行NS1抗原、IgM/IgG抗體和核酸進行檢測，檢測結(jié)果如表1所示。

表1 3例登革病例實驗室檢測結(jié)果

Tab.1Laboratory test results of three dengue fever cases

2.3E基因序列測定結(jié)果3株病毒E基因全長均為1 485個核苷酸，編碼495個氨基酸。核苷酸同源性均為99.87%，氨基酸同源性為99.6%～99.8%。3株病毒與DENV-3核苷酸同源性為70.4%～70.6%。3株病毒編號分別為D1/TZ15/China/2016、D1/TZ16/China/2016、D1/TZ19/China/2016(Genbank ID: KY886977、KY886978、KY886979)。

2.4E基因BLAST及同源性分析通過BLAST與GenBank中已公布的E基因序列進行比對，3株病毒與湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)、廣州株(KR028435/G2/02/2014)均具有較高的一致性，核苷酸同源性分別為99.87%～100%、99.80%～99.93%。其中D1/TZ15/China/2 016株與湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)有相同的核苷酸序列。

注：●臺州市本地感染病毒株；▲各亞型登革病毒代表株
圖2 臺州市I型登革病毒E基因系統(tǒng)進化樹
Note: ●Indicates local infection virus strains; ▲Indicates representative Dengue virus strains
Fig.2 Phylogenetic analysis of E gene of dengue virus type I from Taizhou

2.5系統(tǒng)進化分析3株登革病毒E基因全長序列與GenBank查找24株DENV-I國內(nèi)外流行株和參考株的E基因序列進行進化分析。根據(jù)Rico-Hesse 基因分型法，DENV-I型分為Genotype I～ Genotype V五個亞型[5]。用MEGA6.0相鄰連接法(Neighbor-Joining Method)進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果顯示這3株病毒在同一進化分支上，屬于Genotype I，與湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)、廣州株(KR028435/G2/ZW-0802/2014)、廣州株(KT428609/GZ/92/2014)親緣關(guān)系較近，并與東南亞KJ806871/Malaysia/2014、KJ806872/Singapore/2014病毒株在同一進化分支上。

3 討論

登革病毒是一種通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播的蟲媒病毒，自然界存在4種血清型(DENV-Ⅰ、DENV-Ⅱ、DENV-Ⅲ、DENV-Ⅳ)，可引起登革熱、登革出血熱和登革休克綜合癥等急性傳染病[6]。登革熱已成為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題，廣泛流行于熱帶和亞熱帶的100 多個地區(qū)和國家。我國于1978—1990年在廣東省、廣西省等地發(fā)生過幾次較大的登革熱流行，2014年廣東省暴發(fā)了自1986年以來最大的一次登革熱疫情，共有44 894例患者，死亡6例[7-8]。2014年湖北也暴發(fā)了登革熱輸入病例。浙江省歷史上共發(fā)生兩起本地登革熱疫情，于2004年在浙江慈溪市暴發(fā)I型登革熱疫情，導(dǎo)致113例發(fā)病[9]；2009年義烏市暴發(fā)3型登革熱疫情，導(dǎo)致180例發(fā)病[10]。2016年浙江省臺州市暴發(fā)I型本地感染登革熱疫情，導(dǎo)致3例發(fā)病。

本次研究的登革病毒進化分析顯示，這3株病毒與湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)、廣州株(KR028435/GZ/02/2014)和廣州株(KT428609/GZ/92/2014)親緣關(guān)系較近。廣州株(KR028435/GZ/02/2014)為2014年廣東登革疫情暴發(fā)的代表株[8]，該株病毒主要來源于馬來西亞、新加坡。湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)的傳播來源于廣東、東南亞，與廣州株(KR028435/GZ/ 02/2014)在同一進化分支上。同時進化樹也表明這3株病毒與東南亞病毒株KJ806871/Malaysia/2014、KJ806872/Sing-apore/2014也具有較高的一致性。臺州市暴發(fā)的3例登革熱病例兩月內(nèi)均沒有外出旅行史，不屬于首發(fā)病例，也不能確定屬于幾代病例。系統(tǒng)進化分析表明此次臺州本地登革疫情暴發(fā)可能是首發(fā)病例去過廣東或東南亞，回到臺州未出現(xiàn)典型癥狀，未及時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過多次傳播，導(dǎo)致本地暴發(fā)流行。

目前我國尚未形成登革病毒地方流行區(qū)[9]，浙江省臺州市地處亞熱帶，與廣東、東南亞貿(mào)易頻繁，蚊媒密度高，存在登革病毒傳播和生長的條件，極易使輸入傳染病變成地方傳染病，存在二代病例感染風(fēng)險。臺州往年以輸入病例為主，是首次本地暴發(fā)流行。本次臺州市本地暴發(fā)登革熱疫情提示應(yīng)加強登革熱的防控意識，加強對登革熱及其病毒檢測；加強登革熱相關(guān)專業(yè)知識的培訓(xùn)，提高醫(yī)務(wù)人員的診斷能力。

利益沖突:無

參考文獻

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