高丹草種子半透特性的研究

孫秋瑾，呂燕燕，韓云華，王彥榮

(草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020)

種皮的通透性可控制種胚與外界環境間水分、氣體和養分的交換，對種子的萌發、休眠和貯藏等具有重要的作用[1]。以往研究表明大多數植物種由于半透層的存在，胚包被物顯示出特殊的通透性[2]。半透層(semipermeable layer)是指種胚包被物中存在的一層具有半透性的組織，它允許種子內外水分和氣體的自由交換，而限制或阻止某些溶質的通透[3]。種皮一旦阻礙物質的滲漏，基于滲漏差異的種子質量測定方法將無法檢測出不同活力種子之間的差異。

Thornton[4]在測定種子生活力時發現，由于半透層的存在,常用的四唑鹽測定法并不適用于西瓜(Citrulluslanatus)種子的測定。Beresniewicz等[3]對蔬菜種子種皮透性的研究表明，完整番茄(Lycopersiconesculentum)和辣椒(Capsicumannuum)種子種胚四唑鹽(TTC)染色率低，但刺破種皮后種胚四唑鹽染色率和氨基酸滲漏量均顯著增加，認為種子半透層的存在限制了種皮對四唑鹽的吸收和氨基酸的滲漏，并且不同物種由于種子半透層的存在，種皮透性差異明顯，可根據半透性差異將其分為高透性、中透性和低透性3種類型。在種子活力測定研究中，Hill等[5]的研究表明具有完整種皮的老化和未老化萵苣(Lactucasativa)種子的電解液測定值之間無顯著差異，電導率法也不適用于甜瓜(Cucumismelo)[6]、辣椒[7]及大多數禾草如多年生黑麥草(Loliumperenne)[8]、雀麥(Bromusjaponicus)[9]和老芒麥(Elymussibiricus)[10]等種子活力水平的評價。2003年，王彥榮[11]研究發現蘇丹草(Sorghumsudanense)種皮存在半透層，該組織具有阻礙種子內部電解質外滲和四唑鹽滲入的作用，認為半透層的存在可能是引起電導率法不適用于一些禾草種子活力測定的主要原因。然而迄今為止，關于禾本科牧草高丹草種子半透特性的研究國內外尚未見報道。

高丹草(Sorghumbicolor×Sorghumsudanense)是高粱(Sorghumbicolor)與蘇丹草種間雜交產生的雜種類型。具有分蘗能力強，抗逆性高，適口性好等優良特性，為綜合農藝性狀優良的一年生禾本科飼料作物[12]。本研究以3個高丹草品種冀草2號，冀草8號和冀草008號種子為材料，研究高丹草種子是否存在半透層以及品種間種皮半透性差異，探討種子半透特性與種子活力測定的關系，為種子質量評價方法的應用提供重要的科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試高丹草品種為：冀草2號、冀草8號和冀草008號，由河北省農林科學院旱作農業研究所李源副研究員提供。供試品種收獲于2015年，均貯藏于室溫條件下，初始質量詳見表1。試驗于2016年7月至2017年1月在蘭州大學農業部牧草與草坪草種子質量監督檢驗測試中心(蘭州)進行。

1.2 試驗方法

1.2.1種子老化處理 采用12 cm×12 cm×6.5 cm種子老化盒，盒內加水250 mL，精確稱重后將種子放入盒內支架上，種子距水面約2.5 cm，置于45 ℃，100%相對濕度(老化環境由預試驗確定)培養箱老化。設置9個老化時間梯度，分別為24、36、48、60、72、84、96、108和120 h。嚴格按照老化后的相應時間梯度取出種樣，室溫攤晾使其恢復原重。獲得不同質量的種子用于如下發芽率和電導率試驗。以未老化種樣為對照。

表1 供試種初始質量Table 1 Primary quality of testing seeds

1.2.2吸水率測定 參照王彥榮等[13]的方法測定種子吸水率。每品種數取50粒種子，3次重復，將種子放在三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，置于20 ℃恒溫條件下，用稱重法測定種子在24 h內的吸水量。種子吸水率以種子吸水量占種子初始重量的百分比表示。

1.2.3發芽率測定 參照《牧草種子檢驗規程》(GB/T 2930.4-2001)[14]測定高丹草種子發芽率。選取均勻飽滿一致的種子50粒，設4次重復。采用紙上發芽法，放置光照培養箱中，在20 ℃/30 ℃變溫條件下培養。初次計數為第4天，末次計數為第10天，最終統計正常種苗數、不正常種苗數、新鮮未發芽種子數及死種子數。按以下公式計算種子發芽率：

發芽率=發芽終期全部正常種苗數/供試種子數×100%

1.2.4四唑鹽染色率的測定 隨機數取100粒種子，3次重復。將種子置于蒸餾水中30 ℃預浸泡3 h后取出。預濕后的種子參照《牧草種子檢驗規程》(GB/T 2930.5-2001)[15]，用0.1%的氮紅四唑溶液(TTC)在35 ℃黑暗條件下染色1 h，然后在立體解剖鏡下進行觀察鑒定，以胚完全染成紅色的種子確定為具有生活力的種子。染色結果分為重度染色、輕度染色和未染色。對各種樣用解剖針進行刺破種皮處理，測定刺破種皮種子四唑鹽染色率，測定方法同完整種子。

1.2.5電導率測定 自未老化和老化84 h的種樣中隨機數取50粒種子，每種樣3次重復，精確稱重至0.01 g。將已知重量的種子倒入150 mL三角瓶內，加蒸餾水100 mL，充分搖蕩，用保鮮膜封住瓶口，以僅盛100 mL蒸餾水的瓶子為對照。將各種樣置于20 ℃培養箱，24 h后取出在20 ℃條件下用DDSJ-308A型電導率儀測定浸種液的電導率。根據ISTA活力測定方法[16]，按下式計算各種樣的電導率：

1.2.6熒光染色劑示蹤及觀察 參考Salanenka等[17]熒光染料處理種子的方法。隨機數取40粒種子，用熒光染料干粉包埋種子，避免水分接觸。處理過的種子置于濕沙中20 ℃恒溫培養18～24 h，于胚根伸出前取出，用蒸餾水沖洗種子，濾紙吸干表面水分。將種子用雙面刀片沿胚縱切，用熒光體式顯微鏡(Leica MZ16FA)在藍光(495 nm)下進行觀察并拍照，以未經熒光染料處理的種子為對照。熒光染色劑理化性質見表2。

表2 熒光染色劑理化性質Table 2 Physicochemical properties of fluorescent tracers

1.2.7種子半透層X射線能量色散分析 參考Beresniewicz等[3]硝酸鑭示蹤和X射線能量色散分析的方法，隨機數取50粒種子，去稃，浸泡于雙蒸水中，20 ℃孵育24 h，去除表皮破裂的種子，將剩余種子于4%硝酸鑭溶液(去除CO2的雙蒸水配制)浸泡24 h，室溫晾干。用雙面刀片將種子沿胚縱切，用掃描電鏡(JSM5600LV，日本JEOL)結合X射線能量色散分析儀(EDAX，美國KEVE2)進行鑭元素微區定點分析。

1.2.8種皮透性與種子質量測定的關系 對各種樣進行刺破種皮處理，依據1.2.5方法測定電導率值。

1.3 數據處理

用Microsoft Excel錄入數據，并作圖。采用SPSS 20.0統計分析軟件進行單因素方差分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 高丹草種子吸水率的變化

供試高丹草種子的吸水率均符合典型的吸水動態曲線(圖1)。在0～6 h為種子吸脹階段，之后在最初吸脹的基礎上，進入吸水滯緩期，16～24 h種子吸水率逐漸平穩。24 h時種子吸水率達34.7%(冀草8號)至42.2%(冀草2號)，說明高丹草種皮對水分的通透性良好。20～24 h種子胚根伸出，進一步說明高丹草種皮不影響水分和氣體的交換。

圖1 高丹草種子吸水率的動態變化Fig.1 Dynamic changes of imbibition rate of seeds for Sorghum bicolor×Sorghum sudanense

2.2 高丹草種子對四唑鹽的吸收

完整高丹草種子對四唑鹽的通透性較差，種胚重度染色率冀草2號為5%，冀草8號為0%，冀草008號為2%，其余種子輕度染色或未染色(表3)。刺破種皮處理后3個品種的高丹草種子種胚四唑鹽重度染色率均為100%，與完整種子差異顯著(P<0.01)。

表3 高丹草種子四唑鹽染色率Table 3 Percentage of seeds stained with TTC for Sorghum bicolor×Sorghum sudanense (%)

2.3 不同發芽率種子電導率的比較

圖2 不同發芽率種子電導率比較Fig.2 Comparison of electrical conductivity (EC) of Sorghum bicolor×Sorghum sudanense under different germination rates

老化84 h后獲得發芽率分別為23.0%(冀草2號)，34.7%(冀草8號)和35.3%(冀草008號)的種子。結果顯示，高發芽率種子(未老化)與低發芽率種子的電導率值無顯著差異(P>0.05)(圖2)，如發芽率為92%(未老化)和23%(老化)的冀草2號種子電導率分別為11.93和11.70 μs·cm-1·g-1。表明高丹草種子浸泡液的電導率不隨種子生活力或活力的下降而改變。

2.4 高丹草種子對熒光化合物的吸收

熒光素鈉和鈣黃綠素均能滲透供試3種高丹草種皮(表4)。熒光素(綠色熒光)能滲透冀草2號高丹草種皮，進入種子內部被種胚所吸收，并在種胚部位檢測到明顯的熒光信號；卻被冀草8號和冀草008號高丹草種皮所阻擋，僅在種皮部位出現少量熒光(圖3)。

2.5 高丹草種子半透層的X射線能量色散分析

對照種子內部主要含有C、O、K、Ca元素，無鑭元素(圖片未展示)。圖4A，B和C為經硝酸鑭處理后高丹草種子微區元素的面分布， 種子內部均含有La、C、O、K、Ca元素，其中C、O、K、Ca呈均勻分布。 圖4a， b和c分別為圖4A，B和C相對應部位鑭元素的分布，由此(圖4a，b和c)可見，鑭元素(綠色)均呈條帶狀分布于高丹草種皮靠近胚乳處，未滲入到種子內部。證明高丹草種子存在阻擋鑭鹽滲入的半透層結構。

2.6 高丹草種子發芽率與電導率的相關性分析

完整高丹草種子發芽率與電導率相關性不顯著(P>0.05)(圖5)，相關系數冀草2號為0.103，冀草8號為-0.398，冀草008號為-0.036。刺破種皮處理后，3個品種的高丹草種子發芽率(x)與電導率值(y)均呈極顯著負相關(P<0.01)，可用如下回歸方程表示：

表4 高丹草種子對熒光化合物的吸收Table 4 Seed coat permeability of Sorghum bicolor×Sorghum sudanense to applied fluorescent compounds

冀草2號：y=-0.1897x+41.76(r=-0.976**)

冀草8號：y=-0.29x+52.961(r=-0.951**)

冀草008號：y=-0.2378x+107.52(r=-0.902**)

圖3 高丹草種子對熒光素的吸收Fig.3 Uptake of fluorescein by seeds of Sorghum bicolor×Sorghum sudanense

圖4 鑭示蹤下高丹草種子縱切面微區元素面分布Fig.4 Surface distribution of elements in micro-area under lanthanum tracer

3 討論

圖5 高丹草種子發芽率與電導率的相關性 Fig.5 Correlation between germination and electrical conductivity for Sorghum bicolor×Sorghum sudanense

本研究對高丹草種皮通透性的測定結果表明，高丹草種皮不阻礙水分的吸收(圖1)，未老化種子均能正常發芽表明種皮也不限制氣體的通透，但具有阻礙四唑鹽(表3)、部分熒光染色劑滲入(表4和圖3)和內部電解質滲出(圖2)的作用。通過硝酸鑭示蹤結合X射線能量色散分析證明高丹草種子種胚包被物中存在阻擋鑭鹽滲入的半透層(圖4)，該組織的存在解釋了高丹草種皮顯示特殊通透性的原因。以往對蔬菜種子和禾草種子的研究也表明，半透層具有限制氨基酸[18]等種子內含物滲出、四唑鹽[3-4,11]和鑭鹽[3,19]等大分子物質滲入的作用。

本研究中，鈣黃綠素和熒光素鈉均能滲透3種高丹草種皮(表4)，進入種子內部被種胚所吸收。熒光素能滲透冀草2號高丹草種皮，卻被冀草8號和冀草008號高丹草種皮所阻擋(圖3)。鈣黃綠素能夠滲透高丹草種皮，證明分子量不是限制物質通透的唯一因素，這和Salanenka等[20]對萵苣(Lactucasativa)種子的研究結果一致。熒光素不能滲透冀草8號和冀草008號高丹草種皮，這可能和熒光素相對較高的親脂性有關，較高親脂性的化合物具有有限的親水性，在通過植物組織時會被脂質類物質所阻擋。這一結論似可揭示高丹草種子脂質化的半透層限制了熒光素的通透。以往主要基于對黃瓜(Cucumissativus)[17]、番茄和萵苣[20]等蔬菜種子以及少量牧草種子[21]種皮透性的研究也表明，存在半透層的種子對不同理化性質熒光化合物的滲透特性不同，其半透性差異可能與種皮結構、成分及化合物理化性質等有關。

種皮對電解質滲漏的限制使得基于滲漏差異的種子質量評價方法無法檢測出不同活力種子之間的差異[6-8]。本研究中，完整高丹草種子隨活力下降，電導率與發芽率不相關(圖5)，證明電導率法不適用于高丹草種子活力測定。以往學者對雀麥(Bromusjaponicus)[9]、新麥草(Psathyrostachysjuncea)[22]等禾本科牧草的研究也發現電導率與發芽率不相關的結果。一些學者認為可能由于禾草種子胚乳淀粉含量高[23]，不溶性物質較多[24]，有研究表明這可能與種子代謝強度[25]和內在物質濃度[26]有關而非膜透性變化所致，但也有研究者認為這可能與種皮透性[11]、結構和化學組成有關[27-28]。刺破種皮處理后，高丹草種子電導率與發芽率均呈極顯著負相關，進一步證明高丹草種子種胚包被物中半透層的存在阻擋了種子內部電解質的滲出，從種皮結構和半透性角度揭示了電導率法不能用于高丹草種子活力評價的原因，為其他禾本科牧草種子的透性和基于物質滲漏差異的種子活力測定方法的研究提供參考。

電導率法是評價種子質量和預測田間出苗的有效方法[25,29]，該法已被國際種子檢驗協會(ISTA)推薦為大粒豆類種子活力測定的標準方法[16]。但是許多禾草種子質量下降并非可通過電導率進行檢測[10,13,28]。本研究中，刺破種皮處理后，可用電導率法測定高丹草種子劣變程度，這為確定電導率法的適用范圍提供科學依據，對具有半透層種子活力適宜測定方法的研究奠定了基礎。但刺破種皮后電導率值能否準確預測種子的田間出苗率和耐貯藏性還需要進一步的研究。

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