固相萃取-高效液相色譜法測定地表水中的微囊藻毒素-LR 的方法優(yōu)化

劉 暢

(遼寧省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 沈陽 110161)

引言

微囊藻毒素(Microcystins,MC) 是由藍(lán)藻水華等爆發(fā)所產(chǎn)生的一種單環(huán)七肽物質(zhì),具有明顯的肝細(xì)胞毒性。結(jié)構(gòu)中存在著環(huán)狀結(jié)構(gòu)和間隔雙鍵,因而具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。能夠抑制蛋白磷酸酶活性,是強(qiáng)烈的肝臟腫瘤促進(jìn)劑。隨著有關(guān)微囊藻毒素毒性的不斷深入研究,還發(fā)現(xiàn)其具有多器官毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性和潛在的促癌性,并能引起受試生物發(fā)育異常。中國水體的富營養(yǎng)化程度逐漸加劇,藍(lán)藻水華和赤潮的發(fā)生逐漸增加,80%的藍(lán)藻水華均可檢測出次生代謝產(chǎn)物——微囊藻毒素,其對水體環(huán)境和人群健康的危害已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境問題之一[1]。

微囊藻毒素由于多肽中2 種可變氨基酸組成的不同,具有多種異構(gòu)體。其中,存在最普遍、含量最多的是微囊藻毒素-LR、微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-YR (L、R、Y 分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)。MC 的毒性與其結(jié)構(gòu)相關(guān),研究表明,微囊藻毒素-LR 的急性毒性最強(qiáng),微囊藻毒素-YR 次之,微囊藻毒素-RR 最弱[2]。《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》 (GB 3838-2002)、《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》 (GB 5749-2006)的頒布,將微囊藻毒素-LR 確定為監(jiān)測指標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)限值確定為1μg·L-1,因此,對地表水中微囊藻毒素-LR 測定方法的優(yōu)化及改進(jìn)是很有必要的,改進(jìn)后,方法簡單、靈敏度較高,適合生活飲用水及其水源中微囊藻毒素-LR 的日常檢測。

1 材料與方法

1.1 適用范圍

本方法規(guī)定用液相色譜法測定生活飲用水及其水源中的微囊藻毒素-LR。本方法適用于生活飲用水及其水源中微囊藻毒素-LR 的測定。本方法檢出限為微囊藻毒素-LR 0.01μg·L-1。

1.2 原理

采用固相萃取技術(shù)富集水中微囊藻毒素-LR,洗脫液濃縮后,用具有紫外檢測器的高效液相色譜儀進(jìn)行分離檢測。

1.3 試劑及藥品

配置標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品分析的試劑和材料:所使用的試劑除另有規(guī)定外均為色譜純。

1.3.1 甲醇

每批甲醇都要進(jìn)行空白檢驗(yàn)。

1.3.2 去離子水

超純水儀制備,滿足電阻率≥18.2MΩ·cm-1,TOC＜5μg·L-1。

1.3.3 三氟乙酸

HPLC 專用,純度不低于99.5%。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品

微囊藻毒素-LR 標(biāo)準(zhǔn)樣品(500μg),置于-20℃冰箱中避光保存。

1.3.5 微囊藻毒素-LR 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

將500μg 微囊藻毒素-LR 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶于1.0mL 甲醇(1.3.1) 中,作為500mg·L-1儲備液,置于-20℃冰箱中避光保存。

1.3.6 液相色譜分析用標(biāo)準(zhǔn)中間溶液

取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1.3.5) 用甲醇(1.3.1)稀釋配制到一定濃度。

1.3.7 固相萃取柱

HLB 固相萃取柱(200mg,6mL) 或其它等效固相萃取柱。

1.4 儀器設(shè)備及器皿

高效液相色譜儀,配有二極管陣列檢測器；色譜柱:ODSC18柱 (4.6mm×250mm,5μm)；固相萃取儀；自動濃縮儀。

1.5 樣品的采集及保存

用玻璃容器采集水樣,從采集到萃取前,必須將樣品在4℃下冷藏避光保存,并在7d 內(nèi)對樣品進(jìn)行萃取,萃取后40d 內(nèi)分析完畢。用采水器取5L 水樣,立即加乙酸至樣品體積的5%進(jìn)行固定,置于-20℃冰箱中避光存放。

1.6 分析步驟

1.6.1 樣品前處理

取水樣5L,經(jīng)0.45μm 濾膜減壓過濾。濾液加入0.5%甲醇混合后過HLB 固相萃取柱。固相萃取柱使用之前以10mL 甲醇及10mL 去離子水活化。將水樣以5～10mL·min-1的流速流過固相萃取柱進(jìn)行富集濃縮。上樣完成后,用20%甲醇水溶液10mL 淋洗以凈化樣品,用氮?dú)獯蹈晒滔噍腿≈?用10mL 甲醇(含0.1%的三氟乙酸) 以1mL·min-1的流速將固相萃取柱中的微囊藻毒素洗脫,洗脫液收集于濃縮瓶內(nèi)。另外,用20mL 甲醇(含0.1%的三氟乙酸) 浸泡水樣過濾濾膜,超聲萃取15min,以提取藻細(xì)胞中的微囊藻毒素-LR,將濾膜提取液與水樣洗脫液合并于濃縮瓶中。將合并后的提取液氮吹濃縮至1.0mL 定容,經(jīng)針式過濾器過濾保存,待上機(jī)分析。

水樣中的微囊藻毒素-LR 含量應(yīng)為水體中和藻細(xì)胞中微囊藻毒素-LR 含量之和,所以,在提取水樣中微囊藻毒素-LR 進(jìn)行富集洗脫的同時,要提取藻細(xì)胞中的微囊藻毒素-LR,進(jìn)而確保水樣中微囊藻毒素-LR 的全面檢測。

1.6.2 液相色譜分析條件(推薦)

色譜柱:ODS C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流動相:甲醇∶水(含0.1%的三氟乙酸)=60：40(V/V)；流速:0.8mL·min-1,等速洗脫；進(jìn)樣體積:10μL；色譜柱溫:30℃；檢測器:配有二極管陣列檢測器,測定波長238nm；保留時間、特征吸收譜圖定性,外標(biāo)法峰面積定量。

1.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用甲醇將500mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋,配制成0.2mg·L-1、0.5mg·L-1、1.0mg·L-1、2.0mg·L-1、5.0mg·L-1和10.0mg·L-1的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)使用液。在推薦的液相色譜分析條件下,對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣,以微囊藻毒素-LR 含量(mg·L-1) 對峰面積(μV·s) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程線性良好,相關(guān)系數(shù)為0.999。

1.7 精密度和準(zhǔn)確度

分別取質(zhì)量濃度為1.0mg·L-1、2.0mg·L-1、5.0mg·L-1和10.0mg·L-1的微囊藻毒素-LR 溶液進(jìn)行平行測定,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～8.9%。添加以上濃度水平的水樣進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),回收率為74.7%～94.6%[3]。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱及洗脫溶液用量的選擇

目前固相萃取主要采用C18、HLB 固相萃取柱,分別對2 種固相萃取柱的生活飲用水中微囊藻毒素-LR 富集、凈化效果進(jìn)行了考察,C18 柱回收率變化較大,檢測穩(wěn)定性一般,HLB 柱對微囊藻毒素-LR 有較好的富集效果,回收率穩(wěn)定,檢測可重復(fù)性良好,因此,采用HLB 固相萃取柱,規(guī)格為200mg、6mL。關(guān)于洗脫過程甲醇用量的確定,分別采用6mL、8mL、10mL、12mL 甲醇溶液進(jìn)行洗脫,實(shí)驗(yàn)表明,10mL 甲醇可將微囊藻毒素-LR 充分洗脫。向甲醇中加入0.1%的三氟乙酸,洗脫效果顯著提升,因此,最終選擇10mL 甲醇(含0.1%三氟乙酸)[4]。

2.2 流動相及流速的選擇

流動相組分和流速的選擇會影響色譜峰的出峰時間和對稱性,同時也會影響到基線的波動,本文選用了固定配比的甲醇和水(含0.1%三氟乙酸) 作為流動相,在選定流速下考察對微囊藻毒素-LR 的色譜行為。

結(jié)果表明,隨著甲醇比例的增大,待測化合物的保留時間縮短,并且峰形漸好。但是當(dāng)甲醇比例增加到90% (體積比) 時,待測物出峰較早,對于多種微囊藻毒素的同時測定,則會表現(xiàn)為出峰時間間隔過短。綜合考慮出峰時間以及峰形優(yōu)化,最后選擇流動相配比為甲醇∶水 (含0.1%三氟乙酸)=60：40(V/V)。

此外,本文也在選定流動相配比的情況下,考察了流速變化對測定微囊藻毒素-LR 的影響。結(jié)果表明,隨著流速的增大,出峰時間明顯縮短；當(dāng)流速為0.5mL·min-1時,完成測定需要32min；當(dāng)流速為0.8mL·min-1時,完成測定需要20min；當(dāng)流速為1.0mL·min-1時,完成測定需要16min。但是考慮到流速為1.0mL·min-1時,多種微囊藻毒素的同時測定時色譜峰間隔過短,并且試劑用量較大,選擇流動相流速為0.8mL·min-1,利于今后將方法拓展為多種微囊藻毒素的同步檢測[5]。

3 注意事項(xiàng)

樣品采集、分析過程做好質(zhì)量把控和質(zhì)量保證工作,以保證測試數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性；從采集到萃取前,必須將樣品在4℃下冷藏避光保存,盡快分析[6]；萃取液濃縮時,氮吹至1.0mL 以下后應(yīng)立即停止,定容,否則待測物會有較大損失；微囊藻毒素-LR 標(biāo)準(zhǔn)儲備液要盡快使用,防止降解影響測試的準(zhǔn)確性,于-20℃冰箱內(nèi)保存,有效期2 個月[7]；微囊藻毒素具有明顯的肝毒性,在實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)最大程度避免任何試劑或標(biāo)樣溶液沾染皮膚,儲備液、系列濃度標(biāo)樣等配置一定要在通風(fēng)櫥中操作[8]。

4 結(jié)語

本文嘗試對固相萃取-高效液相色譜法測定地表水中的微囊藻毒素-LR 的方法進(jìn)行優(yōu)化,固相萃取選擇HLB 固相萃取柱,通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在洗脫液甲醇中加入0.1%的三氟乙酸,洗脫效果顯著提升,最終選擇甲醇(含0.1%三氟乙酸) 作為固相萃取的洗脫溶液；流動相隨著甲醇比例的增大,待測化合物的保留時間縮短,并且峰形漸好,確定最佳流動相配比為甲醇∶水(含0.1%三氟乙酸)=60：40 (V/V)；綜合考慮方法的拓展性,測定多種微囊藻毒素的出峰間隔和試劑成本,確定最佳流動相流速為0.8mL·min-1。改良后,方法操作簡單、靈敏度較高,具有較好的精密度和準(zhǔn)確度,能很好地滿足生活飲用水及其水源中微囊藻毒素-LR 的日常檢測要求。