霍山石斛多糖對衰老模型大鼠腸道消化吸收功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

徐海軍，高溫婷，楊 健，張亞妮，谷仿麗，何曉梅，喬德亮

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院健康養(yǎng)殖與動物疫病監(jiān)測預(yù)警工程技術(shù)中心，安徽 六安 237012；2.安徽省植物細(xì)胞工程技術(shù)中心，安徽 六安 237012)

我國已進(jìn)入老齡化社會。提高老年人的身體健康水平，減少相關(guān)老年疾病的發(fā)生，對于降低社會的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，提高老年人的生活質(zhì)量均非常重要。腸道是動物消化吸收食物中營養(yǎng)素的主要場所，也是動物機(jī)體接觸環(huán)境病原微生物及有毒物質(zhì)的主要部位。中醫(yī)學(xué)自古就有“腸道乃百病之源”的說法。可見保持腸道健康非常重要。霍山石斛是六安市霍山縣著名的道地藥材，為歷史悠久的名貴中草藥，是古代“九大仙草”之一。《本草綱目》記載：霍山石斛具有強(qiáng)陰益精，厚腸胃，平胃氣，長肌肉，益智除驚，輕身延年之功效。研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛的主要有效成分為石斛多糖[1-2]。石斛多糖具有降血脂[3-4]、抗氧化[5-7]、增強(qiáng)免疫力[8]等作用。目前關(guān)于霍山石斛或其他石斛多糖的抗衰老作用已有少量研究[9-13]，但對衰老動物腸道健康影響的研究幾乎未見報道。本項目研究了霍山石斛多糖對衰老模型大鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、腸道消化酶活力和糞中營養(yǎng)素含量的影響，為將霍山石斛開發(fā)成抗衰老保健品提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

SPF級雄性SD大鼠，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心，生產(chǎn)許可證號：scxk(皖)2011-002。

1.2 藥品與試劑

霍山石斛楓斗由安徽省霍山石斛產(chǎn)業(yè)開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心提供(經(jīng)皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院陳乃富教授鑒定為正品)，參照陳乃東[14]的方法提取霍山石斛精制多糖，用蒽酮-硫酸比色法測得霍山石斛楓斗多糖含量為29.4%；蛋白濃度測定試劑盒、蛋白酶活性測定試劑盒、淀粉酶活性測定試劑盒和脂肪酶活性測定試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司；D-半乳糖為Sigma公司產(chǎn)品；氯仿、丙酮、無水乙醇、正丁醇等為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 主要儀器

TU-1901 紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；HK-02 A型手提式粉碎機(jī)(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)；FA1204 B型電子分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司)；RE-52 AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；DD5臺式大容量低速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)。

1.4 實(shí)驗分組及給藥

SD大鼠養(yǎng)至4月齡時開始正式試驗。將30只大鼠隨機(jī)分為對照組、衰老模型組和衰老模型+霍山石斛多糖組，每組10只。衰老模型大鼠的制作參照文獻(xiàn)[15]方法，每天在頸部皮下注射D-半乳糖125 mg·kg-1·BW-1。對照組大鼠每天頸部皮下注射等量生理鹽水。衰老模型+石斛多糖組大鼠每天灌胃霍山石斛多糖溶液，劑量為200 mg·kg-1·BW-1。對照組和衰老模型組大鼠每天灌胃等劑量生理鹽水。每隔7天對大鼠進(jìn)行一次稱重，根據(jù)其體重變化調(diào)整D-半乳糖的注射量和霍山石斛多糖的灌胃量。

1.5 指標(biāo)測定

8周后將大鼠頸動脈放血處死，剪開腹腔，以盲腸為基準(zhǔn)，采集距盲腸基部4cm前的一段回腸食糜，用蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性測定試劑盒分別測定三種酶的活性；采取距盲腸基部6cm前的一段回腸，用中性福爾馬林溶液固定，然后制作石蠟切片，測定小腸絨毛高度和隱窩深度(每只大鼠的回腸作3張不連續(xù)的切片，每張切片上測定3根伸直且形態(tài)完整的小腸絨毛高度和隱窩深度)；取直腸內(nèi)糞便，用凱氏定氮法測定糞中粗蛋白含量，用索氏提取法測定糞中粗脂肪含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用DPS軟件對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Ducan’s進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

各組大鼠回腸組織形態(tài)組織結(jié)構(gòu)、消化酶活性和糞便中營養(yǎng)素含量的測定結(jié)果見表1。從表1可見，與對照組相比，衰老模型組和衰老模型+霍山石斛多糖組的小腸絨毛高度顯著變短(p<0.01)，小腸隱窩深度顯著增加(p<0.01)，小腸絨毛高度：小腸隱窩深度顯著變小(p<0.01)；與衰老模型組相比，衰老模型+霍山石斛多糖組的小腸絨毛高度顯著升高(p<0.01)、小腸隱窩深度顯著降低(p<0.01)，小腸絨毛高度：小腸隱窩深度顯著增加(p<0.01)，表明D-半乳糖誘導(dǎo)的致衰作用對小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)有不利影響，這種作用可被霍山石斛多糖部分逆轉(zhuǎn)，但仍不能恢復(fù)到正常水平。在小腸消化酶活性上，衰老模型組的蛋白酶活性顯著低于對照組和衰老模型+霍山石斛多糖組(p<0.01)，但衰老模型+霍山石斛多糖組的蛋白酶活性與對照組相比，沒有顯著差異(p>0.05)；衰老模型組的淀粉酶活性顯著低于對照組和衰老模型+霍山石斛多糖組(p<0.01)，但衰老模型+石斛多糖組的蛋白酶活性與對照組相比沒有顯著差異(p>0.05)；各組的脂肪酶活性沒有顯著差異(p>0.05)，說明D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老作用對蛋白酶和淀粉酶活性影響較大，且這種作用基本上可被飼喂石斛多糖阻斷。在糞中粗蛋白含量和粗脂肪含量上，衰老模型組和衰老模型組+霍山石斛多糖組的糞中粗蛋白含量顯著高于對照組(p<0.01)，衰老模型組糞中粗蛋白含量顯著高于衰老模型+霍山石斛多糖組(p<0.05)；各組大鼠糞中粗脂肪含量沒有顯著差異(p>0.05)，說明D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老增加了糞中蛋白質(zhì)的排出，飼喂石斛多糖對減少衰老模型大鼠糞中蛋白質(zhì)的排出有一定作用。

表1 大鼠回腸組織形態(tài)組織結(jié)構(gòu)、消化酶活性和糞便中營養(yǎng)素含量的測定結(jié)果(n=10)

注：同一行數(shù)據(jù)標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

衰老又稱老化，通常是指在正常狀況下生物發(fā)育成熟后，隨年齡增加，自身機(jī)能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降，結(jié)構(gòu)、組分逐步退行性變，趨向死亡，不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象[15](P394-396)。生物衰老無法阻止，但可以延緩。D-半乳糖致衰老模型造模時間短、操作簡便、模型易于建成、重復(fù)性好，表現(xiàn)出與自然衰老動物相似的衰老體征，已成為國內(nèi)較公認(rèn)的衰老動物模型[16]。增齡可降低小腸絨毛高度，且伴有小腸隱窩數(shù)量的減少，從而導(dǎo)致消化吸收功能減退[17-18]。連續(xù)皮下注射D-半乳糖0.125g·kg-1·d-142d復(fù)制的衰老模型大鼠小腸粘膜厚度及絨毛高度降低，該變化與26月齡自然衰老大鼠腸道老化程度相當(dāng)[19]。因此，本研究用D-半乳糖致衰大鼠模型來觀察霍山石斛多糖對衰老動物腸道消化吸收功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，在動物模型的選取上是合適的。

本研究發(fā)現(xiàn)給大鼠連續(xù)灌胃200mg·kg-1·BW-1霍山石斛多糖溶液，可以顯著緩解D-半乳糖引起的衰老模型大鼠小腸絨毛高度的降低和隱窩的變深，但不能完全恢復(fù)到對照組的水平。D-半乳糖也使衰老模型大鼠小腸蛋白酶和淀粉酶活性顯著降低，但霍山石斛多糖可以基本消除這種影響。D-半乳糖對衰老模型小腸脂肪酶活性影響不明顯。衰老模型大鼠糞中粗蛋白含量顯著高于對照組，說明衰老模型動物對飼料中的蛋白質(zhì)消化吸收減弱，導(dǎo)致排除的粗蛋白較多。另一種可能是衰老模型大鼠的腸道處于一種低度的炎癥反應(yīng)，有較多的腸上皮細(xì)胞死亡脫落，其分解產(chǎn)物隨糞便一起排出，從而引起糞中粗蛋白水平升高。本研究中衰老動物糞便中粗蛋白水平甚至高于飼料中粗蛋白水平，可以支持這種猜測。三組大鼠糞中粗脂肪含量沒有顯著差異。霍山石斛多糖對小腸脂肪酶活性和糞中粗脂肪含量沒有顯著影響，說明霍山石斛多糖對衰老模型大鼠的脂肪消化吸收影響不明顯。霍山石斛多糖為何對粗蛋白和粗脂肪的消化吸收產(chǎn)生不同影響，其原因有待進(jìn)一步探討。

D-半乳糖衰老模型是在一定時間內(nèi)連續(xù)不斷的注射D-半乳糖，以增高大鼠細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度，并在醛糖還原酶催化作用下，將半乳糖還原成半乳糖醇，后者不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞的正常滲透壓，并伴隨有大量自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙、代謝紊亂的癥狀，短時間內(nèi)引起機(jī)體衰老[20]。霍山石斛多糖具有較好的抗氧化作用[4-6]。因此，霍山石斛多糖對D-半乳糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激的緩解作用可能是霍山石斛多糖的抗衰老機(jī)制之一。

4 結(jié)論

給大鼠連續(xù)灌胃200 mg·kg-1·BW-1霍山石斛多糖溶液，可以改善衰老模型大鼠小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，并對消化酶活性和營養(yǎng)素吸收產(chǎn)生有益影響。該結(jié)果為古人關(guān)于霍山石斛“厚腸胃……輕身延年”的藥理效應(yīng)認(rèn)識提供了實(shí)驗依據(jù)。

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