NGS與常規篩查對地中海貧血基因篩查的結果比較

何淑貞，蒲育棟，蘇煥厚，曹金如，莫麗芳

地中海貧血是一種遺傳性溶血性貧血疾病，由基因缺陷導致機體珠蛋白合成受阻，引起患者貧血或臨床病理狀態，一般從出生時就出現貧血、黃疸、發育不良等癥狀[1-2]。地中海貧血是重點防范遺傳性疾病之一，華南、西南地區是我國地中海貧血高發地區，特別是廣西、廣東、四川等地區[3]。因此，孕前或孕期篩查，對預防地中海貧血患兒的出生十分關鍵。目前臨床上主要是針對23種常規地貧基因進行篩查，操作過程復雜，且對檢測人員要求較高。而高通量測序技術(NGS)可一次性檢測300多種地貧基因，篩查范圍廣，局限性小。因此，本研究以405例廣東籍夫婦為研究對象，探討NGS與常規篩查方法對地中海貧血基因篩查的結果。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2014年10月～2016年10月在醫院進行地中海貧血基因篩查的405例廣東籍夫婦為研究對象，其中男147例，女258例；年齡20～35（27.36±4.20）歲。 納入標準：（1）通過血常規檢測，被視為地中海貧血篩查陽性患者[平均紅細胞體積（MCV）<82 fl，紅細胞平均血紅蛋白量<27 pg，滿足任意一項，被視為地中海篩查陽性患者]。（2）擬行地中海貧血基因篩查。（3）無其他血液性疾病。排除標準：（1）基本資料不全；（2）患有其他血液性疾病；（3）精神異常或認知功能障礙。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 檢測方法 用EDTA抗凝管采集研究對象外周血，每人2管，每管約2 ml，分別用于常規地中海貧血基因檢測和高通量測序地貧基因篩查。

1.2.1 常規篩查 采用跨越斷裂點的PCR（gap-PCR）方法：利用基因檢測試劑盒（深圳亞能生物技術有限公司）進行基因診斷，檢測3種缺失型（-SEA、-α3.7 與-α4.2）α-地中海貧血基因。

采用反向點雜交（RDB）技術，檢測非缺失型（HbWS、HbCS 與 HbQS）α-地中海貧血基因突變及17種β-地中海貧血基因突變（包括71/71M、-28M、-29M、31M、32M、CAP、654M、14-15M、17M、41-42M、43M、βEM、27/28M、IVS1-1M、IVS1-5M、IntM、30M）。

1.2.2 高通量測序 血液樣本-20℃儲存，寄往深圳華大基因公司，經檢測合格后，首先進行DNA提取、純化及質量鑒定，之后文庫構建和定量檢測，然后采用HiSeq2500（Illumina）測序平臺，采用雙端測序方法，測序長度為150 bp，進行基因組測序，并進行生物信息學分析。

1.3 觀察指標 統計兩種方法篩查結果，檢測結果均為陰性的排除地貧，檢測結果均為陽性者確診為地貧攜帶者，計算兩組檢查結果符合率。對兩組結果不一致的樣本，進行Sanger驗證（缺失重復突變用Q-PCR進行驗證），確定相關基因是否變異，分別統計兩種方法的假陽性率、假陰性率、檢出率，并計算兩組每個樣本平均檢測費用。

1.4 統計學方法 應用SPSS20.0軟件分析，計量資料以±s表示，行t檢驗；計數資料以例和百分率表示，行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基因檢測結果比較 通過常規篩查、高通量技術及Sanger或Q-PCR驗證，共確認249例基因檢測為陽性，其中α-地中海貧血基因168例（67.47%），β-地中海貧血基因72例（28.92%），α、β-地中海貧血基因9例（3.61%）。對照組檢出221例（88.76%），研究組檢測出247例（99.20%），研究組的檢出率高于對照組，但差異尚無統計學意義（P>0.05）。

2.2 兩組基因篩查結果比較 研究組檢測23種常規地中海貧血基因的結果與對照組基本一致（表1）。此外，研究組還檢測出25例對照組未檢測出的7種突變（4 例 HbHekinan:α27，6 例 HbOwari:α121，3例 HbQ-Thailand:α74，5 例 Hb Hamilton:β11，2 例 Hb New York:β113，3 例 HBB:c.-23，2 例 HBB:c.316-148），與Sanger或Q-PCR驗證結果完全一致。

2.3 兩組樣本平均檢測費用比較 觀察組每份樣本平均檢測費用為（550.88±60.31）元，顯著高于對照組的（423.47±61.44）元（P<0.05）。

3 討論

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地中海貧血是臨床重點預防的遺傳性疾病，孕期或孕前地中海貧血基因篩查是防止地中海貧血患兒出生的關鍵[4-5]。目前臨床上常用的基因檢測方法大多還停留在跨越斷裂點PCR及膜芯片反向雜交聯合檢測，步驟繁瑣，對檢測技術人員要求較高，并且跨越斷裂點PCR主要是針對α-地貧基因的檢測，而膜芯片反向雜交主要是針對β-地貧基因，局限較大[6]。而高通量測序可一次檢測338種地中海貧血基因突變，效率較高，且準確率高。

在本研究中，405例疑似地中海貧血癥者中，共確認249例基因檢測為陽性，其中常規篩查檢出221例（88.76%），高通量測序檢測出247例（99.20%）。其中NGS檢測23種常規地貧基因的結果與常規篩查方法相同。同時研究組還檢測出25例對照組未檢測出的7種基因突變類型，且與Sanger測序或QPCR驗證結果完全一致。提示研究組的檢出率高于對照組，同時研究組還檢測出對照組未檢測出的突變基因型，表明高通量測序技術可提高檢出率，且檢測范圍廣、效率高，有利于臨床地中海貧血基因的篩查，與陳芳等[7]在母血中胎兒游離DNA進行地中海貧血的無創產前診斷研究結果相似。

高通量測序技術從分子生物學的角度去解讀樣本的生物信息，具有高效性、廣譜性及較高的準確性。本研究結果顯示，觀察組單個樣本基因檢測平均費用顯著高于對照組（P<0.05），由于NGS需要在華大基因進行檢測，所以在費用方面處于劣勢。但近年來二代測序平臺不斷更迭，測序成本正在逐漸下降，因此，未來測序成本將不會是高通量測序技術臨床應用的限制因素。

總之，高通量測序技術，檢出率較高，篩查范圍廣，效率高，有利于臨床地中海貧血基因的篩查。

【參考文獻】

[1]張瀚文,朱寶生.地中海貧血的治療進展及預防[J].中國婦幼保健,2016,31(3):666-668.

[2]杜萌,朱寶生,呂濤.地中海貧血致病機制及基因治療進展[J].醫學動物防制,2017(1):58-61.

[3]楊陽,張杰.中國南方地區地中海貧血研究進展[J].中國實驗血液學雜志,2017,25(1):276-280.

[4]余蕾,張蕾,顧峻嫣,等.高通量測序技術篩查單基因隱性遺傳病[J].臨床檢驗雜志,2015,33(7):481-484.

[5]李兵,尹愛華,駱明勇,等.廣東省常用的3種β地中海貧血產前篩查方案的臨床篩查效果比較[J].中華婦產科雜志,2015(6):434-440.

[6]李朋,張杰.地中海貧血基因檢測方法的研究進展[J].中國婦幼保健,2016,31(4):891-894.

[7]陳芳,朱斌,周萍.母血中胎兒游離DNA進行地中海貧血的無創產前診斷研究[J].中國當代醫藥,2016,23(28):111-113.