廣西漢族人群高血壓與瞬時受體電位香草酸亞型1基因多態性/單倍型相關性病例對照研究

藍子深，何東明，陸永光，唐真武

(廣西欽州市第二人民醫院心內科，廣西 欽州 535000)

心血管疾病是對人類健康威脅最嚴重的疾病之一，在全球死因順位中位居第一[1]。高血壓是心腦血管病主要的危險因素，當前我國高血壓的患病率和絕對死亡數也在快速增長[2]，廣西城鄉居民高血壓患病率也處于快速增長期[3]。高血壓受遺傳、環境共同影響而致，不同民族高血壓患病率及危險因素不盡相同[4]。研究高血壓人群遺傳機制，對精準防控和個性化治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

病例組為欽州市第二人民醫院心血管內科住院及門診的漢族高血壓病患者；對照組為同院體檢科性別相同、年齡±5歲以內的漢族成年健康體檢者。所有的研究對象均為廣西漢族人群，經倫理委員會批準，簽署知情同意書。

高血壓病診斷根據1999年WHO高血壓診斷標準，即收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg。排除繼發性高血壓、冠心病、糖尿病、心肌病、心臟瓣膜疾病、先天性心臟病、甲亢、炎癥、風濕免疫病、腫瘤、嚴重肝腎功能損害及過度飲酒、服避孕藥史。年齡>18歲。

1.2 實驗室檢測方法

使用成品化試劑盒，提取血樣、組織、細胞、唾液中的DNA。使用NanoDrop2000儀器進行OD值檢測，1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA質檢合格，轉移至96孔板，置于-20 ℃儲存備用。

根據NCBI上查找的瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential family vanilloid subtype 1，TRPV1)基因rs222747C/G、rs224534A/G、rs4790522A/C及rs8065080 C/T序列，選擇包含位點的序列并輸入Sequenom公司的引物設計軟件Assay design3.1設計PCR反應和單堿基擴展引物合成。

取1.5 mL EP管中配置PCR master mix ，振蕩低速離心。每個加樣孔中加入4 μL PCR master mix，最后加入1 μL模板DNA(20 ng/μL)混勻，啟動PCR 擴增反應程序。PCR反應結束后，將PCR產物用蝦堿性磷酸酶 (shrimp alkaline phosphatase,SAP)處理，以去除體系中游離的dNTPs。在新1.5 mL EP管中配制堿性磷酸酶處理反應液，在堿性磷酸酶處理結束后，進行單堿基延伸反應。采用MassARRAYNanodispenser RS1000點樣儀，將樹脂純化后的延伸產物移至384-well SpectroCHIPbioarray上，使用MALDI-TOF質譜儀分析，檢測結果使用TYPER 4.0軟件獲取原始數據及基因分型圖，并檢查數據文件的完整性和正確性。

1.3 統計學分析

根據測序的結果直接計算出基因型和等位基因的頻率；通過SHEsisPL在線平臺(http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html)進行Hardy-einberg(H-W)平衡檢驗，對符合H-W平衡的位點進行單倍型分析。一般情況比較采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗、計量資料采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本情況

本調查共納入病例組177例，對照組207例。兩組男性所占比例分別為49.15%(87/177)和(51.21)106/207，年齡分別為(33.56±9.81)歲和(35.13±8.32)歲，兩組間性別和年齡分布差異均無統計學意義(P>0.05)。兩組人群TRPV1基因的rs17706630、rs222747、rs222749、rs224534、rs4790522 、rs8065080等6個位點基因型頻率符合 Hardy-Weinberg平衡。對照組rs4790521位點基因型頻率不符合Hardy-Weinberg平衡，兩組rs9894618位點基因型均為CC，這兩個位點未納入進一步分析。

2.2 TRPV1基因6個SNP位點多態性分布

rs8065080位點T等位基因頻率病例組高于對照組，兩組基因型頻率分布相當。兩組人群TRPV1基因的rs17706630、rs222747、rs222749、rs224534、rs4790522等5個位點基因型頻率和等位基因頻率差別無統計學意義。見表1和表2。

2.3 TRPV1基因6個SNP 位點組成的單倍型頻率分布

經SHEsisPL在線平臺分析，6個SNP位點多態性構成頻率>0.03的單倍型共有7種，分別為：GCGACC、GGAAAT、AGGGCT、AGGGCC、GCGACT、AGGGAT和GGAACC。7種單倍型在兩組間分布差別均無統計學意義，見表3。

3 討論

高血壓已成為危害人們健康的主要慢性病之一，是多種慢性疾病的危險因素[5-6]，對人類健康造成重大威脅，一旦發病需要終生治療。高血壓影響因素復雜，既包括性別、年齡、體質指數、家庭人均收入、文化程度、吸煙情況，也受遺傳因素影響[7]。TRPV1，又稱辣椒素受體(vanilloid receptor subtype1，VR1)，屬于瞬時感受器電位家族成員之一，是一個非選擇性配體門控陽離子通道[8]。TRPV1 可被辣椒素、多種內源性配體及酸、熱等刺激因素激活,釋放多種神經活性肽,進而參與痛覺整合、心血管系統調節、抗炎、調節胃腸功能、抗腫瘤等生理和病理生理過程[9]。TRPV1 基因位于人類 17p13 染色體，多個位點存在非同義單核苷酸多態性[10]。目前國內外已有研究證實，TRPV1基因多態性與多種疾病密切相關,且基因多態性在不同民族間存在差異[11]。rs222747、rs4790522位點的多態性與兒童哮喘和特異性咳嗽相關[11-12]；rs224534與痛覺相關[13]；rs8065080位點的多態性可能影響個體對腸易激綜合癥的遺傳易感性[14]，并與膝關節炎相關[15]。

動物實驗表明，TRPV1 能減輕高鹽攝入誘導的氧化應激，減少超氧陰離子產生，提高 NO 的生物利用度，從而改善高鹽膳食導致的阻力血管的內皮依賴性舒張功能的損害，預防高鹽攝入導致的高血壓[16]。也有研究認為，TRPV1 通道能夠通過調節細胞內鈣濃度、血管平滑肌增殖遷移及神經遞質釋放等來調節高血壓等疾病，可能是預防高血壓發生發展的一個有效靶點[17]。

表1高血壓組和對照組6個SNP位點等位基因頻率分布[n(%)]

SNP病例組對照組P值OR值rs177066300.6951.083(0.726～1.615)G300(84.7)355(85.7)A54(15.3)59(14.3)rs2227470.1151.258(0.944～1.677)G161(45.4)165(39.8)C193(54.6)249(60.2)rs2227490.1331.284(0.925～1.783)G257(72.5)320(77.2)A97(27.5)94(22.8)rs2245340.4731.133(0.805～1.594)G82(23.1)87(21.1)A272(76.9)327(78.9)rs47905220.81.04(0.764～1.416)C245(69.2)290(70.1)A109(30.8)124(29.9)rs80650800.0471.335(1.003～1.779)C186(52.6)247(59.7)T168(47.4)167(40.3)

表2高血壓組和對照組6個SNP位點等位基因頻率分布[n(%)]

SNP病例組對照組P值rs177066300.615GA50(28.2)51(24.6)AA2(11.2)4(19.1)GG125(70.6)152(73.4)rs2227470.239GC97(54.8)105(50.7)CC48(27.1)72(34.8)GG32(18.1)30(14.5)rs2227490.102GG92(51.8)118(57.1)GA73(41.2)84(40.5)AA12(7.0)5(2.4)rs2245340.515GA66(37.3)77(37.2)AA103(58.2)125(60.4)GG8(4.5)5(2.4)rs47905220.643CC86(48.6)99(47.9)AC73(41.3)92(44.4)AA18(10.1)16(7.7)rs80650800.127CT88(49.9)103(49.9)TT40(22.5)32(15.4)CC49(27.6)72(34.7)

表3 TRPV1基因6個SNP 位點組成的單倍型頻率分布比較[n(%)]

單倍型SNP1770663022274722274922453447905228065080病例組對照組P值OR值ⅠGCGACC131(37)174(42)0.1560.810(0.605～1.083)ⅡGGAAAT 69(19.4) 60(14.4)0.0641.428(0.977～2.087)ⅢAGGGCT27(7.6)28(6.7)0.6431.138(0.657～1.970)ⅣAGGGCC16(4.5)13(3.1)0.3171.460(0.692～3.078)ⅤGCGACT16(4.5)12(2.8)0.2321.585(0.739～3.398)ⅥAGGGAT10(2.8)14(3.3)0.6580.830(0.364～1.893)ⅦGGAACC 9(2.5)16(3.8)0.3030.648(0.283～1.487)

本研究未能發現廣西漢族人群TRPV1基因8個位點(rs17706630、rs222747、rs222749、rs224534、rs4790521、rs4790522、rs8065080、rs9894618)基因型、單倍型與高血壓關聯，但部分單倍型(如GGAAAT)可能是高血壓危險因素。下一步我們將增大樣本量，并結合環境因素進行分析，以進一步明確TRPV1基因多態性/單倍型與廣西漢族人群高血壓關聯，為防治高血壓提供更準確依據。

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