組蛋白去乙酰化酶抑制劑S25的代謝穩定性和表型研究

溫琥玲，田瑞敏，文丹，胥正敏

(1.川北醫學院附屬醫院核醫學科；2.川北醫學院藥物研究所；3.川北醫學院藥學院，四川 南充 637000)

近年來，組蛋白酶去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACI)成為腫瘤靶向治療研究領域的新熱點。組蛋白去乙酰化酶通過去除組蛋白的乙酰基使DNA緊密的纏繞在組蛋白上，導致DNA不易被相應的基因轉錄因子接觸；進而使受損細胞凋亡，周期阻滯、分化等相關的蛋白表達受到抑制，促進腫瘤的發生發展[1]。HDACI通過增加腫瘤細胞內組蛋白的乙酰化程度，改變細胞周期、細胞凋亡相關基因表達水平，誘導腫瘤細胞分化，抑制腫瘤增殖和(或)促進細胞凋亡，抑制腫瘤細胞侵襲、轉移和腫瘤血管生成等；發揮腫瘤治療或預防的作用[2-5]。依據HDACI結構不同，分為四類：脂肪酸、氧肟酸鹽、環肽和苯酰胺類，S25是本實驗室新合成的苯酰胺類HDACI[6]。新合成的化合物的代謝性質關系到整個化合物是否能夠成藥，并真正的運用到臨床的重要影響因素。肝微粒體是藥物代謝的主要場所[7]，在本研究中，我們將通過體外構建的包括人在內的不同種屬肝線粒體系統研究S25藥物的代謝特征，為該藥的進一步基礎和臨床研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

S25：由本實驗室合成；大鼠肝微粒體(RLM)、人肝微粒體(HLM)、犬肝微粒體(DLM)、猴肝微粒體(MLM)、小鼠肝微粒體(MouLM)購自武漢普萊特生物醫藥技術有限公司，于-80 °C冷凍保存；NADPH發生系統：A液、B液，購自武漢普萊特生物醫藥技術有限公司，于-80 °C冷凍保存；去離子水：Milli-Q實驗室自制；甲醇：色譜純，批號166578，Fisher Scientific公司；乙腈：色譜純，批號155174，Fisher Scientific 公司；甲酸：色譜純，純度99%，ACROS ORGANICS。

超高效液相色譜(UPLC)系統：SIL-30AC autosampler，LC-30AD chromatograph，CBM-20A communications bus module，CTO-20AC prominence column oven，購自SHIMADZU公司。三重四極桿質譜(MS)：AB SCIEX QTRAP5500質譜儀。色譜柱：Waters Acquity UPLCTM BEH C18 column(2.1×50 mm，1.7 μm)；Thermo Heraeus Fresco 17低溫冷凍離心機(Thermo Scientific公司)；230V-UK渦旋混合器(Labnet International公司)；電子天平(賽多利斯儀器(北京)有限公司)；移液槍(德國 Eppendorf公司)恒溫水浴鍋：DF-101S，購自北京市長風儀器儀表公司。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液配制 精密稱取一定量的S25，用甲醇溶解成1 mg/mL的儲備液，4 ℃保存，待用。精密稱取一定量的內標苯酰胺類HDACI辛二酰苯胺異羥肟酸(Suberoylanilide Hydroxamic Acid，SAHA)，用甲醇溶解成1 mg/mL的儲備液，4 ℃保存，待用。

1.2.2 UPLC-MS/MS條件 (1)色譜條件：色譜柱Waters Acquity UPLCTM BEH C18 column(2.1×100 mm，1.7 μm)；流速 0.3 mL/min；樣品室溫度15 ℃；柱溫30 ℃；進樣體積1 μL；流動相A 0.1%甲酸水，B 甲醇，梯度洗脫見表1。(2)質譜條件：電噴霧離子化(ESI)方式，檢測離子為正離子，MRM模式；毛細管電壓5 kV，離子源溫度500 ℃，簾氣 20 L/h, 去簇電壓(DP)120 V。S25和內標化合物的MRM檢測條件，見表2。

表1 S25流動相梯度洗脫條件

表2 F18和SAHA質譜參數優化

1.2.3 S25在不同種屬肝微粒體中代謝穩定性 孵育體系總體積為100 μL，體系包括0.1M pH 7.4 的PBS 94 μL，A液 5 μL，B液 1 μL；在冰浴上加入1 μL S25溶液(濃度100 μM)，37 ℃水浴預孵育5 min，分別加入2.5 μL各種屬肝微粒體溶液，繼續溫孵0，5，15，30，45，60，60 min后加500 μL的含內標50 ng/mL的冰乙腈終止反應，渦旋混勻3 min，13 000 rpm離心15 min，取上清液，進樣。上述每組樣品均平行操作3份。

1.2.4 S25體外代謝動力學參數分析 以各孵育時間點的濃度與孵育0 min時間點S25的濃度相比得剩余百分量，將各時間點的剩余百分量的自然對數對孵育時間作線性回歸，求算得斜率k，根據以下公式可以計算得到半衰期和清除率。其中人、大鼠、比格犬、猴、和小鼠的相關的理化參數如下: Liver (g) / BW (kg) 分別為22、40、33、33 和87.5；Microsomes (mg) / Liver (g)為45[8]。

t1/2=-0.693/k

1.2.5 S25在大鼠肝微粒體中代謝表型 按上述穩定性實驗孵育體系，冰浴上加1 μL濃度為100 μM的S25，1 μL各選擇性化學抑制劑，在37 ℃水浴中預熱5 min，然后冰浴上加入2.5 μL的肝微粒體酶，輕輕混勻。37 ℃水浴中孵育60 min，反應完畢之后加入500 μL含SAHA濃度為50 ng/mL的乙腈溶液(4 ℃)終止反應。

另設定未發生反應樣品為陰性對照組(不加NADPH發生系統，不加抑制劑，只加入等量甲醇)；設定完全發生反應為陽性對照組(加入NADPH發生系統，但不加抑制劑，只加入等量甲醇)。采用UPLC-MS/MS方法檢測S25原形剩余含量，考察不同選擇性抑制劑對S25代謝的影響。用待測物的消除速率表示待測物在微粒體孵育體系中的代謝速率；用Excel、Graphpad prism 5.0和SPSS statistics17.0軟件數據處理系統進行數據處理和制圖。

2 結果

2.1 專屬性

按照“1.2.5”項條件，分別制備實驗肝微粒體溫孵液樣品加內標，滅活肝微粒體空白液樣品，再進行LC-MS分析該方法的專屬性[9-10]。S25和內標SAHA達到基線分離，分離度良好，二者的保留時間分別是2.61 min和3.10 min，提示該方法專屬性良好(圖1)。

2.2 準確度、精密度和基質效應測定

于滅活肝微粒體中加入S25，分為低、中、高3個質量濃度標準液：31.25、125、400 ng/mL，每個質量濃度5個平行樣品；分析計算各質量濃度樣品回收率，表示準確度。同樣方法制備系列質控樣品，日內分別進3次，連續3 d各進樣1次，計算日內、日漸精密度，用相對標準偏差(RSD%)表示。由表3可見，該藥回收率99.41%～106.42%，日內和日間精密度均小于15%，表明該方法具有較好的精密度和準確度。同樣用測定準確度和精密度的方法制得S25質控樣品，同時配制相同質量濃度的S25對照品溶液，LC-MS分析檢測到峰面積分別為A和B，抑制抑制率為=(1-A/B)×100%，基質效應表示為=A/B×100%。其機制抑制率1.09%～6.81%(表3)，小于15%，提示該提取方法無基質效應。

2.3 S25在不同種屬肝微粒體中的代謝穩定性

由S25在人、大鼠、小鼠、犬和猴肝微粒體中孵育時間和底物剩余百分比作散點圖可見，S25在這5種屬肝微粒體中均有明顯代謝；并將S25剩余百分數的自然對數和孵育時間用線性回歸分析(圖2)，S25在各種屬肝微粒體中0～60 min均呈現良好線性關系。其代謝動力學參數見表4，S25在人、小鼠兩種屬肝微粒體中代謝較快且較相近，半衰期T1/2不足1 h，分別在45 min和43.31 min，在大鼠、猴和犬肝微粒體中代謝半衰期時間較長，2～4 h，與人肝微粒體中代謝時間相差較大；在人和小鼠兩個種屬中的代謝清除率也半衰期一樣接近。

表3 S25的準確度、精密度和基質效應測定結果(n=5)

表4 S25在人、小鼠、大鼠、犬和猴肝微粒體中代謝穩定性測定結果

指標人大鼠小鼠犬猴T1/2min45.00187.3043.31130.75198.00CLint/mL·min-1·kg-10.0310.0070.0320.0110.007

2.4 S25在人肝微粒中代謝表型的確定

人肝微粒體中各選擇性P450化學抑制劑對S25的代謝酶活性的影響見表5和圖3。二乙基二硫代氨基甲酸鈉(CYP2E1特異性抑制劑) ，鹽酸塞氯匹定(CYP2C19特異性抑制劑) 和抑制劑磺胺苯吡唑(CYP2C9抑制劑)對人肝微粒體中S25的代謝酶活性抑制率分別是99.99%、84.64%和81.43%，與不加化學抑制劑的陽性對照組相比，代謝酶活性差異均有統計學意義(P<0.01)；其他抑制劑如α-奈黃酮(CYP1A2)和毛果蕓香堿(CYP2A6)對人肝微粒體中S25的代謝酶活性抑制與不加化學抑制劑的陽性對照相比代謝酶活性無統計學意義(P>0.05)；表明CYP2E1，CYP2C19和CYP2C9可能是主要參與代謝S25的酶表型。

表5 各抑制劑對人肝微粒中S25代謝的影響

3 討論

組蛋白乙酰化使染色體構型發生改變而變得疏松，有利于DNA與轉錄因子結合。正常狀態下組蛋白乙酰化和去乙酰化轉移酶處于相對平衡狀態。當細胞發生轉化后，去乙酰化酶活性增強，調控細胞周期和增殖凋亡的基因表達失控，從而使細胞發生異常增殖而惡變。HDACI能使抑癌基因活化，重新調控細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡而具有潛在的臨床意義[11]。目前，已有部分HDACI運用于臨床治療乳腺癌、肺癌等實體腫瘤，也有用于血液系統腫瘤如急性早幼粒細胞白血病(APL)和急性髓性白血病(AML)等[12]。由此可見組蛋白去乙酰化酶抑制劑是抗腫瘤藥物研究的熱點。

S25系本實驗室合成的新型組蛋白去乙酰化酶抑制劑，目前還沒有其作為新藥運用前的代謝動力學方面的研究。因此本實驗建立了人肝微粒體中S25的UPLC-MS/MS檢測方法，其線性、準確度、精密度、基質效應和專屬性均符合生物樣品的測定標準。由本實驗的代謝穩定性實驗結果可見，S25在人和小鼠中的代謝半衰期較短，而與其它3種種屬中代謝半衰期相比差異較大。由此可見，藥物動物實驗和臨床前實驗數據推測臨床給藥方案時，要注意種屬或個體的代謝速率差異。

候選化合物在不同種屬的肝微粒體中的代謝穩定性和代謝表型研究對于化合物體內的代謝性質有很好的預測作用，是藥物開發前期評估候選化合物的有效手段[13]。代謝穩定性的結果提示小鼠與人的代謝性質比較接近，大鼠、犬和猴的代謝性質和人差異比較大，后期實驗動物的選擇可以通過這個結果來做出比較好的判斷；代謝表型的實驗結果表明肝微粒體中主要參與S25的代謝酶可能有： CYP2E1，CYP2C9，和 CYP2C19，；而CYP1A2和CYP2A6對S25則沒有明顯的代謝作用。S25有多種酶代謝，這將降低由于體內某種酶被特異性抑制或誘導而導致的嚴重不良反應的風險。本研究確定了該藥物在人肝微粒體中的代謝穩定性以及該藥物的代謝表型，為今后對該藥物進行進一步的代謝機制方面的研究奠定了基礎。

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