長春瑞濱聯合依維莫司對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制

陳亮，喬紅梅，楊永宏，李芳琴

西安醫學院附屬寶雞醫院腫瘤科，陜西寶雞7210060

乳腺癌是一種常見的危害女性身體健康的惡性腫瘤，其發病率逐年上升，是導致女性死亡的主要原因。據報道，2015年新增乳腺癌病例約為23萬[1]，嚴重影響女性的身體健康和生命安全，因此加強對乳腺癌的診斷與治療是亟需解決的問題。目前，乳腺癌的治療手段主要有化療、放療、手術治療等。臨床研究表明，化療對乳腺癌的治療起著重要作用，對術前、術后乳腺癌患者實行化療，可有效提高乳腺癌的治療效果[2-3]。近年來，隨著藥理學的發展，一些藥物逐漸用于治療乳腺癌，但易產生耐藥性，增加了乳腺癌治療的難度，使其無法達到預期治療效果[4]。本研究探討了長春瑞濱聯合依維莫司對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制，旨在為乳腺癌的治療提供新的思路與方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳腺癌細胞MCF-7購自美國模式菌種收集中心；長春瑞濱、依維莫司、RPMI 1640培養基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；噻唑藍（MTT）、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自南京碧云天生物技術有限公司；40只雄性裸鼠（體重15～20 g）購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2009-0004；磷脂酰肌醇-3激酶（phospoinositide 3-kinase，PI3K）單克隆抗體、磷酸化PI3K（p-PI3K）單克隆抗體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1（serine/threonine kinase 1，AKT1）單克隆抗體、磷酸化AKT1（p-AKT1）單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體均購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠二抗、CO2培養箱均購自美國Thermo公司；流式細胞儀購自美國BD公司；電泳槽購自美國Bio-rad公司；凝膠成像系統購自法國Vilber Lourmat公司。

1.2 細胞培養

將復蘇后的乳腺癌細胞培養于RPMI1640培養基中，加入10%胎牛血清和100 μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，放入37℃、5%CO2的培養箱中，次日更換新鮮培養基繼續培養，待細胞匯合度達到80%～90%時，使用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例進行傳代，在倒置顯微鏡中每天觀察細胞的生長狀態。

1.3 MTT檢測細胞的存活率

將長春瑞濱、依維莫司的濃度分別稀釋為5、10、20、40、60 μg/ml，分別計算依維莫司和長春瑞濱的半數抑制濃度（IC50），作為后續依維莫司組、長春瑞濱組及聯合組的藥物濃度。以每孔1×104個細胞接種于96孔板中，在細胞培養箱中培養過夜，加入長春瑞濱、依維莫司處理細胞，以不加藥物處理的細胞為對照組，置于CO2培養箱中培養48 h，每孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h后終止培養，棄上清，每孔加入150 μl DMSO溶液，置于酶標儀上檢測細胞在570 nm波長下的吸光值（OD值），取平均值，計算細胞的存活率。實驗重復3次。

1.4 流式細胞術檢測細胞的凋亡率

收集各組細胞，采用磷酸鹽緩沖液（PBS）將細胞濃度調整為 1×105/ml，加入 5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，混勻，室溫下避光反應15 min，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.5 裸鼠成瘤動物模型的制備

取生長狀態良好的細胞，采用PBS進行清洗，收集細胞，用無血清培養基與Matrigel膠按3∶1的比例混合重懸細胞，將細胞濃度調整為5×105/100 μl，取100 μl細胞懸液注射至裸鼠右側腹股溝處。飼養條件為20～25℃，自由進食水。待腫瘤大小約為300 mm3時，隨機分為4組，每組10只，采用腹腔注射給藥法。對照組注射等量生理鹽水；長春瑞濱組按裸鼠體重計算給藥劑量，2 mg/kg，qd；依維莫司組按裸鼠體重計算給藥劑量，2 mg/kg，q3d；聯合組注射長春瑞濱（2 mg/kg，qd）+依維莫司（2 mg/kg，q3d）。4組小鼠均腹腔注射，連續注射15 d，測量腫瘤體積和重量。剝離腫瘤，稱取重量，用游標卡尺測量腫瘤的長徑（A）及短徑（B），并按公式V=AB2/2計算腫瘤體積。

1.6 Western blot法檢測細胞中PI 3 K、p-PI 3 K、AKT 1、p-AKT 1蛋白的表達水平

胰酶消化并收集對數生長期細胞，以1×106個細胞接種于培養皿中，細胞貼壁后，使用不同濃度的藥物干預細胞，培養24 h，取出培養皿，冰上靜置，采用PBS清洗2次，加入80 μl細胞裂解液，混勻，吸出上清，根據BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min。配制相應濃度的分離膠和濃縮膠，插入梳子，避免產生氣泡。取10 μl蛋白樣品加入上樣孔，80 V電泳20 min后將電壓調整為120 V繼續電泳，待溴酚藍到達分離膠底部時，停止電泳。將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，使用封閉液室溫封閉2 h，加入適當稀釋濃度的一抗，4℃孵育過夜，TBS/T清洗2次，每次10 min，加入適當稀釋濃度的二抗，室溫孵育2 h，TBS/T清洗2次，每次10 min，滴加ECL化學發光液，顯影1～2 min，沖洗，晾干，采用凝膠成像系統掃描分析相應蛋白的灰度值，與GAPDH的比值為蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.7 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 長春瑞濱聯合依維莫司對細胞存活率的影響

隨著長春瑞濱或依維莫司藥物作用濃度的增加，細胞的存活率逐漸下降，且呈一定的濃度依賴性（P＜0.01）。與對照組相比，5、10、20、40、60 μg/ml的長春瑞濱或依維莫司均可降低乳腺癌細胞的存活率。經軟件分析，長春瑞濱和依維莫司作用于人乳腺癌MCF-7細胞48 h的IC50濃度分別為21.92 μg/ml和30.46 μg/ml。長春瑞濱組、依維莫司組、聯合組的細胞存活率均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；聯合組的細胞存活率低于長春瑞濱組和依維莫司組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1～表3）

表1 不同濃度長春瑞濱對乳腺癌細胞存活率的影響（ n= 3，x-± s）

表2 不同濃度依維莫司對乳腺癌細胞存活率的影響（ n= 3，x-± s）

表3 長春瑞濱聯合依維莫司對乳腺癌細胞存活率的影響（ n= 3，x-± s）

2.2 長春瑞濱聯合依維莫司對細胞凋亡率的影響

長春瑞濱組、依維莫司組、聯合組的細胞凋亡率均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；聯合組的細胞凋亡率高于長春瑞濱組和依維莫司組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖1、表4）

圖1 各組細胞的凋亡率

表4 長春瑞--濱聯合依維莫司對乳腺癌細胞凋亡率的影響（ n= 3，xx± s）

2.3 長春瑞濱聯合依維莫司對腫瘤體積和重量的影響

長春瑞濱組、依維莫司組、聯合組的腫瘤體積和重量均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；聯合組的腫瘤體積和重量均低于長春瑞濱組和依維莫司組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表5）

表5 長春瑞濱聯合依維莫司對腫瘤體積和重量的影響（x-± s）

2.4 Western blot檢 測 細 胞 中PI 3 K、p-PI 3 K、AKT 1、p-AKT 1蛋白的表達水平

對照組、長春瑞濱組、依維莫司組、聯合組細胞的PI3K、AKT1蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；長春瑞濱組和聯合組細胞的p-PI3K、p-AKT1蛋白表達水平均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；長春瑞濱組細胞的p-PI3K、p-AKT1蛋白表達水平均低于依維莫司組，高于聯合組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖2、表6）

圖2 Western blot結果圖

表6 長春瑞濱聯合依維莫司對細胞PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT AKT1蛋白相對表達水平的影響（n=3，，±s）

表6 長春瑞濱聯合依維莫司對細胞PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT AKT1蛋白相對表達水平的影響（n=3，，±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與長春瑞濱組比較，P＜0.05

組別對照組長春瑞濱組依維莫司組聯合組F值P值0.528±0.069 0.578±0.055 0.525±0.061 0.531±0.078 0.430＞0.05 0.510±0.048 0.257±0.031a 0.614±0.062b 0.135±0.012a b 113.704＜0.01 0.942±0.068 0.955±0.058 0.948±0.062 0.962±0.075 0.052＞0.05 0.574±0.055 0.459±0.033a 0.668±0.052b 0.212±0.024a b 89.511＜0.01 PI3K p-PI3K AKT1p-AKT1

3 討論

乳腺癌多發于女性，發病率較高，且近年來呈年輕化趨勢。乳腺癌的產生主要是由于原位癌細胞與正常細胞之間的黏附性降低，導致原位癌細胞易脫落至血液或淋巴液，從而危害患者的生命安全，臨床上表現為乳腺腫塊，皮膚改變，乳頭、乳暈異常等。乳腺癌的臨床癥狀不明顯，不易被發現，臨床上常采取手術結合化療的方式進行治療，但部分患者易出現耐藥現象，嚴重影響治療效果和預后。因此，研究新的化療藥物或方案成為目前乳腺癌研究的熱點之一。長春瑞濱可以與細胞有絲分裂的微管蛋白相結合，阻止雙微體聚合形成微管，能有效抑制癌細胞的有絲分裂，從而抑制癌細胞的生長[5]。研究表明，長春瑞濱對神經的影響較小，具有安全、可靠的治療效果[6-7]。臨床研究表明，長春瑞濱對非小細胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌具有高效的治療效果[8]。另有研究表明，長春瑞濱與曲妥珠單抗聯合治療乳腺癌具有較好的療效[9]。目前，哺乳動物中的雷帕霉素信號通路是研究的熱點之一，激活的雷帕霉素可促進真核起始因子發生磷酸化，提高翻譯水平，從而促進細胞增殖。依維莫司可有效抑制雷帕霉素的活性，具有抑制細胞生長、促進細胞凋亡的作用[10]。本研究探討長春瑞濱聯合依維莫司對乳腺癌細胞增殖、凋亡、瘤體生長的影響。結果顯示，長春瑞濱、依維莫司均可抑制乳腺癌細胞的增殖，誘導其凋亡，且呈一定的濃度依賴性。

裸鼠成瘤實驗常用于研究人類惡性腫瘤的基礎理論和臨床意義，裸鼠具有可穩定生長、性能穩定、易剝離等特點[11-12]。本實驗選取健康的裸鼠，將裸鼠右側腹股溝處作為腫瘤細胞的接種靶點。結果表明，長春瑞濱、依維莫司能夠在一定程度上有效抑制乳腺癌細胞MCF-7裸鼠種植瘤的生長。

PI3K是一種磷脂酰激酶，廣泛存在于細胞質內，受多種細胞因子受體的影響。PI3K可以磷酸化磷脂酰肌醇，從而發揮細胞調節作用[13]。AKT是PI3K的下游靶基因，能被多種轉錄因子直接或間接磷酸化，調控下游靶基因的轉錄[14-15]。活化的AKT可激活雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of repamycin，MTOR），調控腫瘤細胞的侵襲、轉移、化療耐藥等過程，其主要作用是促進細胞增殖，抑制細胞凋亡[16-17]。依維莫司是MTOR抑制劑，研究表明，依維莫司可阻斷MTOR磷酸化，發揮抑制細胞周期和細胞生長，促進細胞凋亡的作用[18-20]。本實驗中，依維莫司對乳腺癌細胞中PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT1表達水平的影響不明顯，表明依維莫司對MTOR上游調控因子無明顯的調節作用。長春瑞濱對乳腺癌細胞中PI3K、AKT1的表達水平沒有明顯的調節作用，但可促進p-PI3K、p-AKT1表達下調。兩者聯合使用可進一步降低p-PI3K和p-AKT1的表達水平，提示依維莫司有可能具有加強長春瑞濱抑制PI3K/AKT1信號通路的作用。

綜上所述，長春瑞濱和依維莫司主要通過調控PI3K/AKT1信號通路抑制乳腺癌細胞增殖，促進細胞凋亡，從而有效抑制腫瘤生長，且聯合作用的效果更好。

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