重組單克隆抗體生產的宿主細胞系的研究進展

劉素霞

摘要：許多表達系統可以表達單克隆抗體，并且也在研究中。CHO細胞是最常用于研究的細胞系，直到今天仍然是單克隆抗體生產的主力。對宿主細胞系進行改造提高產品產量及質量，不同的宿主細胞系生產的產品質量存在差異。

關鍵詞：中國倉鼠卵巢；單克隆抗體；哺乳動物表達系統

1 歷史和科學背景

單克隆抗體（MonoclonalAntibody，mAb）在重組蛋白藥物中占比最大，不僅可以用于人類疾病的治療，還可用于多種疾病的體內成像診斷。

20世紀60年代，人們開始培養骨髓瘤細胞，并且通過化學或輻射方法處理后建立了營養缺陷型細胞株。1975年雜交瘤技術發表，制藥行業很快意識到mAb將成為重磅炸彈。OKT3是第一個動物細胞生產的小鼠mAb，作用于人類T淋巴細胞，用于抑制腎移植手術后的異體排斥。

人們對轉基因植物、轉基因動物以及體外翻譯系統已經研究了數十年，這些生產系統主要的難點是產品效價不足，另外，轉基因植物常常存在多余的糖基化或蛋白水解活性，造成下游操作程序復雜、低效。

2 mAb生產的宿主細胞系

用于重組mAb表達的宿主細胞系主要是CHO，NS0，Sp2/0，HEK293和PER.C6。但是，被批準用于人類治療mAbs生產的細胞系僅有CHO，NS0和Sp2/0。其中，CHO細胞占據了當今工業生產蛋白質藥物的70%。[1]

1986年，首個重組生物藥tPA被批準上市，CHO細胞作為其表達系統也成為重組蛋白表達的首選細胞系。目前，CHO細胞系的mAb生產工藝已經相當成熟，通常批次生產的產量最高可達到1 g/L，流加培養可達到110 g/L。[2]

鼠源細胞系的NS0和Sp2也可用于重組mAb生產，NS0細胞的細胞密度和mAb表達量通常會比CHO細胞的批次培養低10倍。HEK和PER.C6細胞可以表達與人類蛋白質糖基化一致的mAb，HEK293細胞尤其適用于瞬時基因表達，可以在DNA轉染后幾天內收獲蛋白質。

3 mAb生產的宿主細胞工程

研究者們通過過量表達或敲除某個基因，調整代謝途徑、延緩細胞凋亡、增強轉錄表達效率，有效的增加了重組蛋白產量。在重組 CHO 中表達酵母PYC2，可以改變流加培養方式中葡萄糖的代謝速率，增長細胞的對數生長期，從而增加細胞密度及產量。應用鋅指結構核酸酶完全敲除CHO 細胞的Bak和Bax基因，IgG表達提高25倍。[3]

4 mAb生產中的“產品質量”

在不同細胞系統中表達的mAb的一級序列主要由轉入基因的密碼子決定，但翻譯后修飾決定了重組蛋白質的微觀不均一性，并對其溶解度，穩定性，藥代動力學，效力和生物活性具有顯著影響。

蛋白質的糖基化可影響蛋白質的藥理活性、生理生化特性以及藥代動力學性質，半乳糖基化對于介導補體依賴性細胞毒性（CDC）是相當重要的。α1，6巖藻糖基通過與FcγRIIIa受體的特異性抗體結合，從而在抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）中起作用，CHO表達的mAb含有高達90%的巖藻糖化，通過基因工程改造使其缺乏α1，6巖藻糖基，可增加mAb的ADCC活性。唾液酸化有利于增加mAb的血清半衰期，但也有報道說末端唾液酸會減少ADCC活性。[4]

將mAb應用于體內之前，需要嚴格控制產品的質量，蛋白質的結構、環境條件或生產過程等因素使得重組蛋白在生產及儲存過程中可能會發生聚集，形成較大顆粒，若是治療性蛋白質可能會因此失去生物活性，甚至出現免疫反應或其他副作用。[5]

5 mAb生產的現有及先進技術

細胞培養技術在過去幾十年里已經相當成熟，并逐漸發展成為一種相對可靠和強大的技術。大約30年前，“老”生物過程通常以分批模式運行一周，最大細胞濃度為3×106cells/ mL，重組蛋白產量約為100 mg/L。二十年后，由于改善了基礎培養基以及補料策略，mAb表達量達到15g/L。現在，生產工藝得到進一步的發展，產品表達量可以超過10 g/L。

物理參數（例如溫度，氣體流量），化學參數（例如pH，滲透壓，溶氧）和生物學參數（例如細胞密度，存活力，細胞周期）都會顯著影響產品質量和生產效率，特別是對產品的糖基化，翻譯后修飾水平和雜質類型方面有顯著影響。要獲得符合質量要求且產量高的mAb，培養操作參數的優化是極其重要的。

6 結論

大約75%的科學出版物從一開始就使用CHO細胞。因此，在接下來的幾十年中，CHO細胞可能仍然是哺乳動物細胞培養中蛋白質表達的主力。與此同時，已經開展了許多替代表達系統的開發，特別是對于一些新形式或人工改造的mAb變體。只要它們能夠達到期望的質量，甚至可以在低等真核生物或原核生物中表達。

參考文獻：

[1]Valente KN，Levy NE，Lee KH.Applications of proteomic methods for CHO host cell protein characterization in biopharmaceutical manufacturing.Curr Opin Biotechnol.2018，53：144150.

[2]Wang W，Zheng W，Hu F，et al.Enhanced Biosynthesis Performance of Heterologous Proteins in CHOK1 Cells Using CRISPRCas9.ACS Synth Biol.2018，7（5）：12591268.

[3]Toussaint C，Henry O，Durocher Y.Metabolic engineering of CHO cells to alter lactate metabolism during fedbatch cultures.J.Biotechnol，2015，217：122131.

[4]黃嘉慧，汪才坤，覃錦紅，等.N糖基化對TNFRFc融合蛋白結構穩定性和生物活性的影響.中國生物工程雜志，2016（5）：1219.

[5]李敏，常衛紅.生物制品質量標準研究與建立一般原則的探討.中國新藥雜志，2017，26（16）：18871893.