賴瑞聯(lián) 陳瑾 馮新
摘? 要? 橄欖是中國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物,其中多酚類物質(zhì)是橄欖重要的功效成分之一。目前,橄欖多酚類物質(zhì)研究較為廣泛,常用的提取方法包括溫浸法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超聲與微波協(xié)同輔助提取法等,分離純化后采用液相色譜或液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定多酚類物質(zhì)的種類和成分,并對(duì)其抗氧化、抗病毒、抗菌消炎、抗癌抑癌、解酒護(hù)肝和提高機(jī)體免疫等方面的藥理活性進(jìn)行驗(yàn)證。此外,橄欖多酚類物質(zhì)合成和代謝分子機(jī)理也已經(jīng)被初步闡釋。基于上述研究報(bào)道,本文進(jìn)一步對(duì)橄欖多酚類物質(zhì)后續(xù)研究方向和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用前景進(jìn)行展望。
關(guān)鍵詞? 橄欖;多酚;研究進(jìn)展;藥理活性中圖分類號(hào)? S667.5 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A
DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.029
橄欖(Canarium album(Lour.) Raeusch.)是我國(guó)熱帶亞熱帶地區(qū)特色名貴果樹,也是國(guó)家衛(wèi)計(jì)委公布的藥食同源作物之一[1]。中國(guó)是橄欖種質(zhì)資源起源和主要分布中心,福建、廣東、廣西、云南、海南、臺(tái)灣和浙江等南部?。▍^(qū))均有橄欖分布和栽培,此外,越南、緬甸和馬來(lái)西亞等東南亞國(guó)家也有少量橄欖分布[2-3]。橄欖作為我國(guó)南方傳統(tǒng)藥用果樹和重要經(jīng)濟(jì)作物,已經(jīng)融入當(dāng)?shù)氐拿袼缀臀幕?,橄欖產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新、種質(zhì)資源挖掘、功效成分開發(fā)利用等也越來(lái)越受關(guān)注。
我國(guó)橄欖種質(zhì)資源極為豐富,為更好實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用,并將資源優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì),除篩選更符合大眾口味的鮮食橄欖品種,還需關(guān)注橄欖功效成分及其附加產(chǎn)品的創(chuàng)新與開發(fā)利用[4]。研究表明,橄欖具有解酒保肝[5-6]、抗菌消炎[7]、提高機(jī)體免疫[8]、抗氧化[9]、抗癌抑癌[10-11]、修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨[12]等藥理活性。而橄欖的功效成分種類和含量豐富,主要包括精油[13]、類黃酮[14-15]、多糖[9]、多酚[16]、礦質(zhì)元素[17]、萜類物質(zhì)[6]及氨基酸[18]等,其組成成分和分子結(jié)構(gòu)均有相關(guān)報(bào)道。其中,多酚類物質(zhì)是橄欖最重要且含量最高的功效成分,也是影響橄欖鮮食品質(zhì)的核心指標(biāo)之一[19-22]。目前,橄欖多酚類物質(zhì)研究也取得了較大進(jìn)展[23-25]。本文主要從提取分離、純化鑒定、藥理活性及分子生物學(xué)等幾個(gè)方面對(duì)國(guó)內(nèi)外橄欖多酚類物質(zhì)研究概況展開綜述,并對(duì)橄欖多酚類物質(zhì)后續(xù)研究方向和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用前景進(jìn)行展望。
多酚類物質(zhì)是來(lái)源于莽草酸途徑與苯丙氨酸途徑的一類具有芳環(huán)結(jié)構(gòu)并結(jié)合一個(gè)或多個(gè)羥基的化合物[26]。由于多酚類物質(zhì)富含羥基,其通常能溶于水且易溶于甲醇、乙醇和丙酮等極性較大的有機(jī)溶劑,而在有氧與高溫條件下易被氧化為醌[27]。因此,橄欖多酚類物質(zhì)提取時(shí)大多使用水、乙醇或丙酮溶液作為提取液,且提取溫度通常介于20~72 ℃。根據(jù)浸提過(guò)程中輔助手段不同,橄欖多酚類物質(zhì)提取方法大致分為5類,見圖1。提取橄欖多酚類物質(zhì)后,通常采用酒石酸鐵法、福林酚試劑法和紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行含量測(cè)定。向麗等[28]初步建立了基于福林酚比色法橄欖多酚類物質(zhì)測(cè)定體系:酚試劑1.5 mL、10% Na2CO36 mL,于30 ℃下反應(yīng)60 min,置于765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定。而謝倩等[29]對(duì)酒石酸鐵法、福林酚試劑法和紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種方法均具有良好的重復(fù)性,其中紫外分光光度計(jì)法操作簡(jiǎn)便且成本不高,可作為橄欖多酚類物質(zhì)測(cè)定的理想方法。

圖1橄欖多酚類物質(zhì)的提取過(guò)程
Fig. 1? Extraction process of polyphenols inC. album
1.1 溫浸法
溫浸法是指在利用水或乙醇溶液作為溶劑提取橄欖多酚類物質(zhì)時(shí),通過(guò)水浴等方法為提取體系提供一定的溫度,從而促進(jìn)提取液與物料接觸的一種提取方法。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單且不需要復(fù)雜的設(shè)備,但提取時(shí)間較長(zhǎng)。影響溫浸法提取橄欖多酚類物質(zhì)效果的關(guān)鍵因素包括提取溫度、溶劑的種類與濃度、提取時(shí)間、料液比等(表1)。綜合提取效果與操作過(guò)程的便捷程度,適合橄欖果肉多酚類物質(zhì)提取的溫浸法提取工藝為:去核果實(shí)干燥粉末以1∶20的料液比投入60%~70%丙酮水溶液中,在20~30 ℃的環(huán)境下攪拌60 min,提取得率可達(dá)到16.9%;而橄欖葉片多酚類物質(zhì)提取的最佳溫浸法提取工藝為:烘干葉片粉末以1∶25的比例投入50%的乙醇溶液中,提取3次,提取144 min,其得率約14.7%。此外,采用賢景春等[30]建立的溫浸提取法測(cè)定橄欖根中多酚類物質(zhì)含量為6.015 mg/g,也說(shuō)明橄欖根中的多酚類物質(zhì)含量較低。
1.2 超聲波輔助提取法
超聲波輔助提取法是指將提取體系置于一定頻率的超聲波環(huán)境下,利用超聲波的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)及機(jī)械作用促進(jìn)多酚類物質(zhì)溶解到溶劑中的一種提取方法。這種方法具有提取時(shí)間短、效率高等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)避免高溫對(duì)多酚類物質(zhì)的破壞,但提取噪音大,并且當(dāng)提取量較多時(shí),需較大的設(shè)備提供充分功率的超聲波。超聲波輔助提取法影響因素較多,包括溶劑的種類與濃度、超聲波功率、提取時(shí)間和料液比等(表2)。經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化,從提取效果與可操作性上看,適合橄欖果肉多酚類物質(zhì)提取的超聲波輔助法提取工藝為:去核果實(shí)干燥粉末以1∶20的料液比投入60%~70%丙酮水溶液中,置于80 W功率的超聲環(huán)境中提取25 min,其多酚提取率可達(dá)到17.8%。而孔佳祥等[40]的方法提取橄欖葉片總多酚類物質(zhì)得率約為8.9%。
1.3 微波輔助提取法
微波輔助提法是將提取體系置于一定的微波環(huán)境下,利用微波的穿透及內(nèi)部迅速加熱的特性,使橄欖多酚類物質(zhì)快速轉(zhuǎn)移到提取體系。該方法提取時(shí)間短、能耗小且避免了長(zhǎng)時(shí)間加熱對(duì)多酚的損耗,但提取操作煩瑣,成本較高[44]。目前,微波輔助提取法在橄欖中的研究和應(yīng)用較少,何志勇等[45]通過(guò)試驗(yàn)初步篩選了適宜微波輔助提取橄欖多酚類物質(zhì)的工藝為:在1∶20的料液比中,將橄欖材料投入60%~70%的丙酮水溶液中,在340 W的微波中提取5 s,其多酚提取得率約為18.6%。
1.4 超聲與微波協(xié)同輔助提取法
超聲與微波協(xié)同輔助提取法是同時(shí)利用超聲波與微波的優(yōu)點(diǎn),優(yōu)化最佳體系提取橄欖多酚類物質(zhì)。目前,超聲與微波協(xié)同輔助提取法在橄欖中也有不少研究報(bào)道。何志勇等[45]建立了基于超聲與微波協(xié)同輔助的橄欖多酚類物質(zhì)提取方法,即橄欖干燥果實(shí)粉末按照1∶10~1∶15投入60%~80%乙醇水溶液中,設(shè)定超聲波功率為50 W,微波功率為100~600 W,提取0.5~3 min。項(xiàng)昭保等[46]則采用響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化,進(jìn)一步篩選出最適體系:橄欖干燥果實(shí)粉末按照1∶30投入62%乙醇水溶液中,設(shè)定超聲波功率330 W,微波功率550 W,提取4.4 min,使橄欖多酚類物質(zhì)提取效率大幅度提高。
1.5 亞臨界水提法
亞臨界水提法是指在一定的壓力下,以溫度處于100 ℃至臨界溫度范圍的亞臨界水為溶劑,進(jìn)行橄欖多酚類物質(zhì)提取的一種方法。這種方法不需使用有機(jī)溶劑,更為環(huán)保,但提取時(shí)需要使用密閉的提取設(shè)備,壓力與體積的乘積一般會(huì)超過(guò)3 MPa/L,具有一定的危險(xiǎn)性,且操作程序更為煩瑣[47]。目前已知的橄欖多酚類物質(zhì)亞臨界水提法具體提取工藝為:將果肉干燥粉1∶20~1∶30的料液比投入萃取釜中,設(shè)定壓力為5~10 MPa,溫度為200~270 ℃,提取時(shí)間為20~60 min[48]。
2.1 橄欖多酚類物質(zhì)的純化與鑒定
橄欖多酚類物質(zhì)的純化與鑒定根據(jù)目的可分為兩類,一類是將橄欖提取液初步除雜純化獲得粗提物,然后采用液相色譜的方法鑒定提取物中已知的多酚類物質(zhì);另一類是通過(guò)固液分離-萃取分相-柱層析梯度洗脫從而獲得橄欖多酚,然后通過(guò)液相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)橄欖多酚的種類和成分進(jìn)行鑒定。
2.1.1? 果肉多酚類物質(zhì)純化與鑒定 ?目前已鑒定的橄欖果肉多酚類物質(zhì)主要包括沒(méi)食子酸、綠原酸、短葉蘇木酚酸、芥子酸、金絲桃苷、穗花杉雙黃酮、槲皮素和香豆酸等34種(表3)。此外,何志勇等[43]還發(fā)現(xiàn)了橄欖果肉中另外5種不確定的多酚類物質(zhì),其中2種可能互為異構(gòu)體的鞣花酸,2種6-羥基聯(lián)苯二甲酸衍生物及1種相對(duì)分子質(zhì)量為348的未知多酚類物質(zhì)?;陂蠙於喾宇愇镔|(zhì)分離鑒定技術(shù),在橄欖高功效品種篩選時(shí),林玉芳等[49]采用高效液相色譜法對(duì)不同橄欖品種多酚類化合物組分含量進(jìn)行比較分析,確定了‘馬坑22號(hào)為高鞣花酸含量品種,‘檀頭為高蘆丁品種,而‘霞溪本同時(shí)富含2種組分。
2.1.2? 葉片多酚類物質(zhì)純化與鑒定 ?橄欖葉片多酚類物質(zhì)純化與鑒定研究報(bào)道相對(duì)較少。鄭賢民[38]和王宗舉[56]等通過(guò)大孔吸附樹脂分離法對(duì)橄欖葉片提取液中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行研究,分別將多酚類物質(zhì)的純度提高到了68.52%和71.20%,并通過(guò)液相色譜鑒定獲得橄欖葉片中沒(méi)食子酸、槲皮素、穗花杉雙黃酮和蘆丁等4種多酚類物質(zhì)。
2.2 橄欖多酚類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析
根據(jù)已有報(bào)道,目前鑒定獲得橄欖葉片和果肉中34種已知多酚類化合物,采用Integle中的InDraw模塊對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行查詢與繪制,結(jié)果見圖2。
3.1 解酒護(hù)肝
橄欖汁液素有解酒保肝的功效。張怡等[5]通過(guò)對(duì)酒精性肝損傷的小鼠喂食橄欖汁后發(fā)現(xiàn),橄欖汁及其透析液能夠顯著降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和脂質(zhì)過(guò)氧化物,有效激活全血超氧化物歧化酶和乙醇脫氫酶,而橄欖透析液中包含大量多酚類物質(zhì),其中類黃酮物質(zhì)含量最高,證明橄欖多酚類物質(zhì)具有解酒保肝藥理活性。此外,Ito等[57]利用橄欖中分離純化獲得的幾種多酚類物質(zhì),對(duì)離體培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行抗毒肝素活性試驗(yàn)認(rèn)為,短葉蘇木酚、金絲桃苷、鞣花酸及3,3′-二甲氧基鞣花酸這4種多酚類物質(zhì)可能在保肝護(hù)肝過(guò)程中發(fā)揮主要作用。



3.2 抗氧化
二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)和鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)測(cè)定是橄欖多酚自由基清除能力和抗氧化活性鑒定中常用的方法[32]。研究表明,橄欖多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基(ABTS+·)、DPPH·、羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-·)和亞硝酸鹽(NO2-)清除能力及鐵離子還原能力,可作為天然的食品抗氧化劑[58-60]。此外,Kuo等[61]也發(fā)現(xiàn)橄欖乙醇水溶液提取物的抗氧化效果和自由基清除能力與提取液中多酚類物質(zhì)存在量效關(guān)系。而在具體抗氧化成分鑒定中,呂鎮(zhèn)城[54]、林鈺郡[62]和Chang[63]等研究認(rèn)為,橄欖多酚類物質(zhì)的抗氧化主要組分包括槲皮素、山奈酚、鞣花酸、沒(méi)食子酸、3-O-沒(méi)食子酸奎寧酸、老鸛草素及異柯里拉京等。此外,利用不同溶劑提取時(shí),80%丙酮溶劑獲得的橄欖多酚類物質(zhì)具有更高的抗氧化活性,而其具體影響因素則有待進(jìn)一步研究[64]。
3.3 抗癌抑癌
脂質(zhì)代謝是人體代謝的重要組成部分,脂類代謝紊亂可能引發(fā)機(jī)體癌變。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn),橄欖中的多酚能夠激活肝癌細(xì)胞中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路,下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP-1)和脂肪酸結(jié)合酶(FAS)表達(dá),同時(shí)上調(diào)過(guò)氧化物媒體增殖物活化受體(PPAR-α)表達(dá),從而抑制細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)度積累,起到抗癌抑癌的生理功能。此外,向麗等[11]也通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),橄欖多酚類物質(zhì)能夠有效抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖,同時(shí)激活caspase-3表達(dá),從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明橄欖多酚
類物質(zhì)具有抗癌抑癌功能。
3.4 抗病毒
Duan[8]等研究表明,橄欖果實(shí)乙酸乙酯提取物能夠抑制人體免疫缺陷病毒(HIV)糖蛋白跨膜單元gp41中介導(dǎo)HIV病毒侵染目標(biāo)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)——六螺旋束的形成,并通過(guò)進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸是提取物中的主要功能成分之一。此外,橄欖多酚類物質(zhì)能夠明顯抑制乙肝病毒HBsAg/HBeAg在HepG22細(xì)胞中的自我復(fù)制,具有抗乙肝病毒的藥理活性,且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒害作用,而發(fā)揮這種抗性的組分主要是沒(méi)食子酸和鞣花酸[65-66]。
3.5 其他
橄欖多酚類物質(zhì)在降低血糖、提高機(jī)體免疫和抗菌消炎等方面同樣具有很好的功效。張潤(rùn)普等[67]研究發(fā)現(xiàn),喂食橄欖多酚類物質(zhì)可顯著增加大鼠骨密度和骨鈣含量。王瑤等[68]研究表明,橄欖多酚類物質(zhì)對(duì)口腔頜面常見的致病菌也有較好的抑菌作用。此外,橄欖多酚能夠抑制機(jī)體α葡萄糖苷酶活性及恢復(fù)胰島素分泌,從而抑制糖尿病小鼠血糖升高[69]。
橄欖分子生物學(xué)研究起步較晚,其多酚類物質(zhì)合成和代謝機(jī)理報(bào)道較少。王云梅[70]和張慶舉[71]等首先對(duì)橄欖葉多酚代謝途徑上游基因進(jìn)行克隆,獲得了對(duì)-香豆酸輔酶A連接酶C4H、苯丙氨酸解氨酶PAL、肉桂酸-4-羥化酶4CL、黃烷酮- 3-羥化酶F3H、查爾酮異構(gòu)酶CHI和查爾酮合成酶CHS等基因序列,并通過(guò)生物信息學(xué)分析初步揭示了橄欖多酚代謝機(jī)理。隨后,賴瑞聯(lián)等[72]開展橄欖CHI基因密碼子特征分析,為其基因功能和分子進(jìn)化研究提供了科學(xué)依據(jù)。而黃敏杰等[73]通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),橄欖類黃酮3′-羥化酶F3′H基因與多酚類物質(zhì)在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的變化趨勢(shì)相符,驗(yàn)證其在多酚合成和代謝中發(fā)揮重要調(diào)控功能。此外,隨著現(xiàn)代高通量測(cè)序研究和應(yīng)用的不斷深入,李安玉[74]以多酚類物質(zhì)含量差異較大的‘長(zhǎng)營(yíng)和‘清欖橄欖為材料,初步挖掘出橄欖兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶COMT、肉桂醇脫氫酶CAD、過(guò)氧化物酶POD、丙二烯氧化環(huán)化酶AOC、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶TAT、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶HPPD、黃酮醇合成酶FLS、黃酮3-O-單氧酶F3M和阿魏酸-5-羥基化酶F5H等一系列橄欖多酚代謝關(guān)鍵基因,進(jìn)一步揭示了橄欖多酚類物質(zhì)合成和代謝分子機(jī)理。
5.1 橄欖多酚類物質(zhì)組分和基礎(chǔ)應(yīng)用研究
大量研究結(jié)果表明,橄欖多酚類物質(zhì)在抗菌消炎、保肝護(hù)肝、抗癌抑癌、降低血糖和提高機(jī)體免疫等方面具有良好的藥理活性,開發(fā)應(yīng)用市場(chǎng)前景廣闊。然而,目前橄欖多酚類物質(zhì)研究和應(yīng)用還處在初級(jí)階段,對(duì)其中發(fā)揮具體藥理活性的組分研究較淺,許多橄欖多酚結(jié)構(gòu)和種類也并不明確,仍有必要進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)并加以開發(fā)利用,提高橄欖多酚類物質(zhì)的利用效率。另一方面,橄欖不同品種間多酚含量和種類差異較大,需要加大橄欖種質(zhì)間多酚類物質(zhì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)挖掘,為橄欖高功效品種篩選提供參考。此外,橄欖多酚類物質(zhì)提取分離方法種類多樣,在產(chǎn)業(yè)開發(fā)時(shí)關(guān)注提取效果的同時(shí),也需要結(jié)合食品安全標(biāo)準(zhǔn),注重提取產(chǎn)物的安全性和規(guī)范化,保證橄欖多酚類物質(zhì)可食性,開發(fā)橄欖多酚天然保健食品、天然保鮮劑和抗氧化劑。
5.2 橄欖多酚類物質(zhì)合成和代謝分子機(jī)制闡釋
生物體中,數(shù)量性狀及其特征質(zhì)量性狀的改變起源于基因差異表達(dá)。目前,橄欖多酚類物質(zhì)合成和代謝相關(guān)分子機(jī)理研究較少,其關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不明確,在后續(xù)研究中可以結(jié)合現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)開展mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA組學(xué)研究,橄欖基因組草圖構(gòu)建以及橄欖多酚代謝組學(xué)關(guān)聯(lián)分析,進(jìn)一步闡釋橄欖多酚類物質(zhì)合成和代謝的分子機(jī)制。此外,結(jié)合SNP等第3代分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)橄欖多酚類物質(zhì)合成相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確定位,可為橄欖高功效定向育種提供分子輔助技術(shù)。
5.3 橄欖多酚類物質(zhì)藥理活性開發(fā)
在藥理活性研究方面,在橄欖多酚類物質(zhì)組分分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)上,可采用CAP-e法[75](基于紅血球細(xì)胞抗氧化保護(hù)能力,Cell— based antioxidant protection in erythrocytes)、CAA法[76](細(xì)胞抗氧化活性,Cellular antioxidant activity)等,結(jié)合氧化損傷細(xì)胞模型法,開展不同結(jié)構(gòu)多酚的抗氧化活性研究,進(jìn)一步明確橄欖多酚類物質(zhì)的藥理活性。
綜合分析,目前橄欖多酚類物質(zhì)研究和利用水平較低,后續(xù)應(yīng)主要開展以下幾個(gè)方面研究:一是橄欖多酚的高效制備工藝和穩(wěn)態(tài)化技術(shù)開發(fā);二是橄欖多酚種類的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定;三是橄欖高多酚含量種質(zhì)篩選與多酚合成機(jī)理闡釋,四是橄欖多酚的藥理活性挖掘,最后進(jìn)行橄欖多酚相關(guān)功能性產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用。隨著這些工作的開展,橄欖多酚類物質(zhì)的研究與利用體系將更加完善,作為一種新型天然活性物質(zhì)發(fā)揮廣闊的市場(chǎng)前景。
參考文獻(xiàn)