氣相色譜-質(zhì)譜法測定熱帶水果中植物甾醇的含量

李濤 李琪 林麗云

摘? 要? 為探究熱帶水果中植物甾醇的種類和含量。將香蕉、火龍果、木瓜、菠蘿、龍眼樣品進(jìn)行冷凍干燥處理、索氏抽提、皂化提取、衍生，采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法進(jìn)行麥角甾醇、菜油甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇的分析測定，并用膽甾烷醇內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明：菜油甾烷醇、麥角甾醇均為未檢出。5種甾醇的含量總和為4.05～34.89 mg/100 g，含量順序為火龍果>菠蘿>木瓜>香蕉>龍眼。

關(guān)鍵詞? 植物甾醇;氣相色譜-質(zhì)譜法;熱帶水果中圖分類號? R151.3???? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

植物甾醇是一類天然功能活性物質(zhì)，廣泛存在于植物細(xì)胞與組織中。植物甾醇與膽固醇具有同樣的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，區(qū)別在于其側(cè)鏈的不同^[1]。植物甾醇可以抑制人體對膽固醇的吸收，防止動脈硬化，同時，還具有抗腫瘤、提高免疫力等多種生理功能^[2]。人體內(nèi)不能合成植物甾醇，也不能由膽甾醇轉(zhuǎn)化而成，只能由食物中攝取^[3-4]。因此，在每日膳食結(jié)構(gòu)中所攝入的食品、農(nóng)產(chǎn)品中植物甾醇的種類和含量等方面的研究受到人們越來越多的關(guān)注。

近年來，文獻(xiàn)報道對甾醇的測定方法有薄層色譜法^[5]、電化學(xué)法^[6]、液相色譜法^[7]、氣相色譜法^[8]等，每種方法都有優(yōu)、缺點。氣相質(zhì)譜法因其具有較高的靈敏度和精密度、可以同時多組分分析、不需要大量的試劑作為流動相等優(yōu)點得到廣大研究者的認(rèn)可。楊春英等^[9]采用氣相質(zhì)譜法測定14種食用植物油中的植物甾醇，陳樹東等^[10]采用氣相質(zhì)譜法測定植物油。文獻(xiàn)報道中甾醇的研究多集中在糧油谷物^[9-12]，水果方面的甾醇研究主要是蘋果、梨、桃等一些溫帶水果^[13]。關(guān)于熱帶水果的甾醇種類和含量的論文鮮有報道。因此，為了滿足消費者的消費需求，本研究采用氣相質(zhì)譜法對幾種熱帶水果甾醇進(jìn)行測定分析，填補(bǔ)熱帶水果甾醇含量的數(shù)據(jù)，為熱帶水果后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)和加工提供數(shù)據(jù)支撐。

1? 材料與方法

1.1? 樣品?

本研究選取香蕉、菠蘿、木瓜、火龍果、龍眼5種熱帶水果為研究對象，在超市、水果店等消費環(huán)節(jié)隨機(jī)取樣，每個品種取5個樣品，每個樣品采樣量在1 kg，將每個品種的5個樣品勻漿作為一個品種的樣品進(jìn)行分析。

1.2? 儀器與試劑

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（5975C），美國Organmation公司;冷凍干燥機(jī)（ALPHAI-2LD），德國CHRIST公司;超低溫冷凍儲存箱（BCD-5654DS），中科美菱;氮吹儀（N-EVAP24），美國Organmation公司;索氏浸提儀（2050），美國Foss Analytical AB;電子天平（AUX 220），日本島津。

麥角甾醇（純度98%）、菜油甾烷醇、菜油甾醇（純度98%），J&K公司;豆甾醇（純度95%）、谷甾醇（純度≥97%），Sigma公司。

正己烷、二氯甲烷、丙酮（均為色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;石油醚、氫氧化鉀、乙醇（均為分析純），廣州化學(xué)試劑廠，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.3? 方法

1.3.1? 樣品制備? 取樣品可食部分，冷凍干燥處理（14 Pa，-50 ℃，24～48 h），粉碎過40目篩，備用。

1.3.2? 水分測定? 參照GB 5009.3-2010進(jìn)行水分測定。

1.3.3? 脂肪提取? 參照GB/T 5009.6-2016將1.3.1的備用樣品進(jìn)行油脂抽提。

1.3.4? 總甾醇的皂化和提取? 取油脂樣品100 μL，加入50 μg膽甾烷醇作為內(nèi)標(biāo)，用2 mol/L KOH乙醇溶液4 mL和二氯甲烷0.5 mL渦旋震蕩1 min混勻。70 ℃水浴震蕩45 min，室溫冷卻。加入二氯甲烷5 mL，超純水3 mL混合均勻，離心后去除上清液，再用5 mL超純水洗3次下層液體（每次去除上清液），氮吹儀吹干有機(jī)相備用。

1.3.5 ?TMS衍生? 加入100 μL衍生劑MSHFBA∶1-MIN（95∶5，V/V）75 ℃衍生20 min，正己烷定容1 mL過濾膜上機(jī)檢測。

1.4? 儀器工作條件

1.4.1? 色譜條件? 毛細(xì)管柱：HP-5MS柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）;升溫程序：起始溫度100 ℃保持1 min，以50 ℃/min升至250 ℃，然后以10 ℃/min升至280 ℃，保持17 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃;柱流速：1.2 mL/min。

1.4.2? 質(zhì)譜條件? 電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，監(jiān)測方式：SIM模式。

1.5? 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取甾醇標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用丙酮溶解并定容至5 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。在-20 ℃保存。

1.6? 數(shù)據(jù)處理

采用氣相色譜法-質(zhì)譜法對待測組分進(jìn)行測定，根據(jù)保留時間定性、峰面積定量，以膽甾烷醇為內(nèi)標(biāo)參比計算甾醇含量。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

考察60、80、100、120 ℃共4個水平的起始柱溫，為了使目標(biāo)化合物較好地分離和提高分離效率，最終確定100 ℃為柱子起始溫度，并保持1 min，以50 ℃/min升至250 ℃。確定起始溫度后，升溫速率是影響分離的關(guān)鍵因素，選取5、10、15、20 ℃/min共4個升溫速率優(yōu)化實驗，升溫速率為5 ℃/min時，分析時間久且峰形差;升溫速率為15、20 ℃/min時，分析時間短，但容易出現(xiàn)重疊峰，目標(biāo)化合物分離不完全。因此，根據(jù)目標(biāo)化合物的分離效果、峰型、分析時間等因素。確定采用10 ℃/min為最佳升溫速率。實驗條件優(yōu)化后升溫程序為起始溫度100 ℃，保持1 min，以50 ℃/min升至250 ℃，然后以10 ℃/min升至280 ℃。在此條件下，目標(biāo)化合物在17 min內(nèi)得到較好的分離。并采用SIM掃描模式針對目標(biāo)化合物的特征離子進(jìn)行監(jiān)測。定性定量離子參數(shù)見表1，總離子流圖見圖1。

2.2? 線性范圍和檢出限

在最優(yōu)的實驗條件下，配制一系列濃度的甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測試，標(biāo)準(zhǔn)曲線中谷甾醇濃度為200、150、100、50、25、10、5 μg/mL甾醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他甾醇濃度見表2。進(jìn)樣體積為1 μL。以甾醇濃度為橫坐標(biāo)，峰高為縱坐標(biāo)，計算得出標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限，從表3可知各甾醇具有良好的線性關(guān)系。

2.3? 加標(biāo)回收實驗

在樣品中添加2、5、10 mg/kg濃度，測定各甾醇的回收率，按1.3方法進(jìn)行皂化、提取、衍生，其加標(biāo)的回收率在78%～102%，回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.0%，說明本研究的方法精密度和準(zhǔn)確度良好。

2.4? 樣品中甾醇的含量測定

植物甾醇含量、香蕉的脂肪含量均以干基計，樣品中水分含量和脂肪含量見表4。從表5可知，5種樣品中菜油甾烷醇、麥角甾醇均為未檢出，菜油甾醇的含量范圍為0.55～16.41 mg/100 g，含量較高的為菠蘿。豆甾醇的含量范圍為0.36～ 20.03 mg/100 g，含量較高的為火龍果。谷甾醇的含量范圍為3.52～16.51 mg/100 g，含量較高的為菠蘿。5種甾醇的含量總和為4.05～34.89 mg/100 g，由多到少為火龍果>菠蘿>木瓜>香蕉>龍眼。

3? 討論

植物甾醇測定的種類為麥角甾醇、菜油甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)把這5種植物甾醇分類^[14]，豆甾醇、麥角甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷醇屬于同一類，由于這一類的甾醇廣泛分布于植物中，目前文獻(xiàn)對這一類的研究較多。本研究建立了采用GC-MS分析熱帶水果中植物甾醇含量的方法，該方法高效、科學(xué)、準(zhǔn)確。利用該方法分析香蕉、火龍果、木瓜、菠蘿、龍眼樣品中的植物甾醇，均為未檢出菜油甾烷醇和麥角甾醇。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組成成分^[15]，菜油甾烷醇是植物甾醇的飽和形式，含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于植物甾醇的含量，因此，未檢出屬于正常范圍^[14]。菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇3種植物甾醇在5種熱帶水果中均有檢出，這說明，熱帶水果在植物甾醇方面值得做詳細(xì)研究。同時，韓軍花等^[13]采用氣相色譜儀檢測分析木瓜樣品中菜油甾醇含量為5.35 mg/100 g、豆甾醇含量為2.87 mg/100 g、谷甾醇含量為8.63 mg/ 100 g，同本研究采用氣相色譜質(zhì)譜法測定木瓜樣品中的3種甾醇含量相近。

本研究的5種熱帶水果樣品中，其中火龍果脂肪含量和植物甾醇含量較高?；瘕埞竞枯^高的主要貢獻(xiàn)是火龍果籽，火龍果籽富含油脂，火龍果籽含油率在30%左右。而植物甾醇主要存在于油脂中，火龍果的植物甾醇可能主要存在于火龍果果肉中的火龍果籽中，目前對火龍果籽研究較多的在脂肪酸、氨基酸等方面。希望今后對火龍果籽中植物甾醇方面可以系統(tǒng)研究。同時本研究發(fā)現(xiàn)火龍果的豆甾醇含量較高。有研究表明^[16]，豆甾醇可以有效預(yù)防某些癌癥，包括卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等。

消費者攝入植物甾醇的來源主要是谷物、堅果、蔬菜和水果^[17]。雖然從含量上看水果中植物甾醇含量遠(yuǎn)低于植物油、堅果、谷物等。但從每日攝入量分析，消費者每日攝入量較多的是水果和蔬菜，通過本次對香蕉、火龍果、木瓜、菠蘿、龍眼5個品種的植物甾醇含量不同，高于目前韓軍花等^[13]文獻(xiàn)中報道的西瓜、桃等。建議消費者多食用不同種類的水果，不僅是為了補(bǔ)充水分、維生素、糖還可以補(bǔ)充植物甾醇等成分。熱帶水果品種豐富，后續(xù)研究應(yīng)對更多品種的熱帶水果分析植物甾醇的種類和含量，在探究熱帶水果在植物甾醇方面貢獻(xiàn)率的同時指導(dǎo)消費者更加合理科學(xué)地消費。

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