利用SRAP分子標記分析杧果種質遺傳多樣性

羅世杏 唐玉娟 黃國弟 宋恩亮

摘? 要? 利用SRAP分子標記技術對來自12個國家或地區的54份杧果種質進行了遺傳多樣性分析，并對SRAP標記在杧果研究中的效率做了探討。結果表明，SRAP標記在杧果種質中具有豐富的多態性，引物多態性條帶百分比在79.31%～100%，平均為93.10%;引物的有效等位基因數（N_e）、Neis基因多樣性指數（H）、Shannons信息指數（I）和多態性信息含量（PIC）平均值分別為1.73、0.41、0.60和0.87，表明SRAP標記具有較高的多態性檢測效率?；赟RAP標記計算獲得的遺傳相似系數對杧果種質做聚類分析，54份杧果種質可被劃分為3個類群。主成分分析與聚類分析反映的種質親緣關系基本一致。

關鍵詞? 杧果;序列相關擴增多態性;遺傳多樣性;聚類分析;主成分分析中圖分類號? S667.7 ?????文獻標識碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.007

杧果為著名熱帶水果之一，因其果肉細膩，風味獨特，深受人們喜愛，素有“熱帶果王”之譽稱。我國杧果栽培已有1 300多年歷史。經適栽培地區有廣西、廣東、海南、四川、云南、臺灣等省區。目前廣西壯族自治區杧果種植面積已居全國各種植省區的首位，但杧果種質資源研究手段相對落后，傳統的自然雜交、田間選育等育種手段的廣泛使用導致杧果雜交親本選配上仍存在很大的盲目性，限制現有杧果種質資源的有效利用。隨著植物遺傳連鎖圖譜的構建、指紋圖譜的繪制、種質資源的遺傳多樣性研究、基因定位等分子生物學方法^[1-3]的廣泛應用，從分子水平上為評估不同種質間的遺傳多樣性提供了技術支持，借助分子生物學的手段輔助選擇育種，為廣西現有杧果種質資源研究創新利用提供新的思路，提高育種效率。近年來，ISSR標記^[4]、AFLP標記^[5]、SRAP標記^[6]、SSR標記^[7]及SCoT標記^[8]均已應用于杧果遺傳多樣性方面的研究，但前人借助SRAP分子標記手段進行杧果遺傳多樣性分析的供試材料數量少，來源不夠廣泛，系統性和代表性不足，不利于廣西杧果種質資源的挖掘和利用。

SRAP標記是一種基于PCR的標記技術，具有簡單、可靠、中通量率以及高百分率的片段來自編碼區的特點。SRAP標記主要用于生物多樣性的分類鑒定、遺傳圖譜的構建、重要性狀基因標記、基因克隆和雜種優勢利用等^[9-11]，SRAP技術的獨特引物設計，在具備了RFLP、RAPD、SSR、AFLP等分子標記優點的同時還彌補了其存在的缺陷^[12]，在育種目標性狀的評價方面優于其他標記方法，目前已廣泛應用于香蕉、蘋果、荔枝等園藝作物^[13-18]的遺傳多樣性分析，是一個評價遺傳多樣性、品種鑒定的有效工具^[8]。本研究在前期的研究^[19]基礎上采用SRAP標記進一步對來自12個國家和地區的54份杧果種質進行較為系統的親緣關系探究和遺傳多樣性分析，為有效整理分類廣西杧果種質資源、保護和利用現有種質提供理論支持，為今后杧果育種的親本選配提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

54份杧果種質資源來自世界上12個不同國家和地區（表1），由國家杧果種質資源保護廣西創新基地提供。

1.2? 方法

1.2.1? DNA提取? 每份材料隨機采集10片杧果嫩葉，采用CATB法提取杧果嫩葉的基因組DNA，用紫外分光光度計檢測DNA質量和濃度，–20 ℃保存備用。

1.2.2? SRAP標記檢測? 選擇栽培地域遠、表型差異大的5份杧果DNA作模板，用144對引物進行PCR擴增（表2），篩選出擴增條帶清晰、多態性高的引物32對。SRAP-PCR擴增參照趙英等^[16]的方法，PCR擴增體系為：94 ℃預變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，5個循環;94 ℃預變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，35個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。擴增產物用7.5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，并拍照記錄。

1.3? 數據分析

每個樣品的擴增電泳帶型按有（1）和無（0）記錄，建立分子數據矩陣，不同膠板以DNA電泳分子量標準、特征帶和公共帶對應，找到對應條帶。利用NTSYS 2.10軟件通過非加權平均法（UPMGA）計算杧果種質間的遺傳相似系數，并在此基礎上作聚類分析及主成分分析。采用POPGENE 32軟件估算SRAP分子標記的主要遺傳多樣性參數：引物擴增總條帶數（TNB）、多態性條帶數（NPB）、多態性條帶百分比（PPB）、有效等位基因數（N_e）、Neis基因多樣性指數（H）、Shannons信息指數（I）和多態性信息含量（PIC）。

2? 結果與分析

2.1 ?SRAP-PCR引物的篩選與擴增結果多態性分析

SRAP正反向引物各12條，兩兩組合成144個引物組合，用5個地域來源遠、表型差異大的杧果試材對引物組合進行篩選，最終選出32個擴增條帶清晰并且重復性和多態性良好的引物組合，引物組合me1-em5擴增結果如圖1所示。

利用32對引物組合對54份杧果試材進行擴增，具體擴增結果匯總于表3。從表3可以看出，共擴增出898條清晰可見的條帶，其中多態性條帶836條，平均每對引物擴增條帶數為28.06條，多態性比率（PPB）為93.10%;單對引物擴增出來的總條帶數差異較大，每對引物組合擴增出的條帶數和多態性條帶數分別為16～37條和16～36條不等;多態性條帶百分比在不同引物間也有較大差異，其分布在79.31%～100%。有效等位基因數N_e的變異范圍為1.52～1.96，平均為1.73;Neis基因多樣性指數H分布在0.33～0.49，均值為0.41;Shannons信息指數I介于0.51～0.68，平均值為0.60;多態性信息含量（PIC）主要變化范圍在0.80～0.92，其均值為0.87。結合這些引物的綜合表現，SRAP標記對杧果種質資源具有較強的鑒別能力，適合于杧果遺傳多樣性關系研究。

2.2? 不同杧果種質聚類分析

基于SRAP標記的擴增結果，用NTSYS 2.10軟件計算杧果試材資源間的遺傳相似系數（GS），構建了54份杧果種質的遺傳聚類分析圖（圖2）。從圖2可知，在遺傳相似系數0.695的位置大致可將54份杧果種質資源劃分為3個大類群，其中第I類群包括的杧果種質數量最多，主要是國內各省區的杧果種質資源，為29個，占總數的53.70%;第II類群包括9個杧果種質，來自于緬甸、泰國、印度等東南亞國家，說明這些地區的杧果種質可能具有較為相似的遺傳背景;除了南逗邁4號外，美國、澳大利亞和越南的杧果種質組成了第III類群，南逗邁4號芒分在了第III類群可能是因為其遺傳背景較為復雜。而越南杧果種質的遺傳關系研究報道較少，現有資料中無法得知其親本的遺傳背景，還需進一步探究其與美國、澳大利亞聚為一類的原因。從圖2還能清楚地看出，在相似系數以0.72為截值時，可將第I類群分為3個亞類群。第I亞類群除了矮芒外，其余種質均來自于廣西各地的杧果種質，這一亞類群的13份杧果資源相關系數在0.725以上;第II亞類群絕大多數來自于云南，與四川金龍芒聚為一類，這與黃麗芳等^[7]的研究分類基本一致。這可能是因為金龍芒是龍眼香芒與三年芒雜交獲得的植株。第III亞類混合了四川、海南、廣東、臺灣的杧果種質，共有8份資源，這一亞類中存在相關系數為1的情況，如乳芒和龍眼香芒，這可能是因為乳芒是龍眼香芒的實生后代。第II類群的杧果種質主要由印度、緬甸和泰國的杧果種質組成。

2.3? 杧果種質的主成分分析

基于SRAP標記數據對54份杧果種質做了主成分分析形成平面圖（圖3）。前3個主坐標所能解釋的相關性分別為0.21%、0.18%和0.26%。圖3中不同杧果種質位置距離的遠近反映了其親緣關系的密切程度，種質間距離越近，說明遺傳關系越近，遠離則說明親緣關系較遠。利用主成分分析對54份杧果種質進行分類，共得到5個主要類群（A、B、C、D和E類群）。其中A群分布在第1象限，B類群主要分布在第1和第3象限，C類群主要分布在第2象限，D類群分布在第2、第3和第4象限，E類群分布在第4象限。這與UPGMA聚類結果相似，A、B和C類群相當于UPGMA聚類中的第I類群的三個亞類，D類群和E類群分別相當于第II和第III類群。云南矮芒距離廣西杧果群較云南杧果群更近，因此將其與廣西杧果種質歸為一類，這與UPGMA聚類結果一致。第II類群中的貴妃芒在主成分分析中歸入D類群，可能是因為貴妃是白象牙與凱特的雜交后代。E類群中的海豹杧交錯在第1象限中，可能是因為海豹芒是來自印度尼西亞的杧果種質資源，其遺傳背景較為復雜。比較圖2和圖3可以看出，系統分類法和主成分分類法所得的分類結果基本一致，主成分分析結果能夠對聚類結果進行直觀解釋和側證。

3? 討論

3.1? 杧果種質SRAP標記的多態性和有效性分析

序列相關擴增多態性（SRAP）是一個基于PCR的標記技術，具有多態性高、重復性好、較易對擴增得到的目的片段進行測序的特點，正向引物和反向引物兩兩結合的方式可以通過少量的引物得到多對引物對，從而提高引物的使用效率。本研究用32對引物對54份供試材料進行SRAP擴增，擴增出898條DNA條帶，平均多態性條帶百分比為93.10%，遠高于趙英等^[6]利用22對SRAP引物組合對12份杧果種質資源進行遺傳多樣性研究的結果，這可能是因為本研究收集的供試材料數量更為豐富，并且采用的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染等實驗手段，分辨率更高。石勝友等^[20]研究獲得的總擴增條帶數、多態性條帶數位、多態性條帶百分比明顯低于本研究的SRAP分子標記。黃麗芳等^[7]和Luo等^[8]分別采用SSR和SCoT分子標記手段，其所獲得的擴增條帶數及多態性信息含量均低于本研究。本研究還對擴增產物在杧果種質多態性方面進行了較為系統的評價分析，共參考了擴增條帶總數（TNB）、多態性條帶數（NPB）、多態性條帶百分比（PPB）、有效等位基因數（N_e）、Neis基因多樣性指數（H）、Shannons（I）和多態性信息含量（PIC）共7個參數。在PPB方面，有7對引物組合基因組擴增條帶的多樣性達到了100%，平均多態性條帶百分比為93.10%，說明SRAP標記在杧果基因組中具有豐富的多態性。N_e、H、I作為SRAP引物多態性評價的重要參數，在本研究中表現良好，其平均值分別達到了1.73、0.41和0.60。作為評價分子標記多態性的重要指標，本研究中的PIC均值為0.87，遠大于0.5，說明本研究篩選所得的引物組合為高度多態性信息引物。較于前人利用分子標記手段所得的數據，綜合本研究結果，評判后可說明SRAP在杧果種質中具有更高的鑒別能力，更能提供杧果種質差異的遺傳信息。

3.2? 杧果種質資源的遺傳多樣性分析

杧果種質資源的遺傳多樣性分析有助于了解種質間的親緣遠近，便于開展種質創新及新品種選育工作。本研究利用SRAP標記技術對來自不同國家和地區的杧果種質遺傳多樣性進行了較為系統的分析，分析結果顯示，杧果種質資源間的遺傳變異系數均值為0.706 5，說明杧果種質資源的遺傳多樣性水平較高，這與前人研究結果相同^[4]。從本研究SRAP擴增結果來看，54份杧果種質大致可分為3個群組，而I類群中的廣東、海南、四川和臺灣杧果種質與廣西杧果種質分屬不同亞類，這與黃麗芳等^[7]將廣東、海南和廣西杧果種質分屬同一類群不同，可能是因為本研究所采用的杧果種質試材和種質數量與其不同，而這對遺傳多樣性水平有較大的影響。

了解杧果種質資源的遺傳變異信息及親緣關系，是有目的地選配親本、培育優良品種的基本手段和方法。本研究采用的2種分析方法所得的杧果種質遺傳關系的聚類情況與其種質來源和生態區有較高的相關性，說明分子標記分析基本支持以生態型和品種來源劃分杧果品種，這與前人研究^[21]的結論基本一致。聚類分析和主成分分析結果顯示，國內的杧果種質資源可分為3組群，大多數種質間的遺傳相似系數在0.72～0.83，而且遺傳變異度小，這可能與基礎育種材料的頻繁利用有關，說明國內杧果種質的雜交親本遺傳差異不夠豐富，其遺傳基礎較為狹窄。因此，在進行杧果新品種選育時，應加大發掘和利用國外優良杧果種質資源力度，注重選擇遺傳差異大的親本雜交，拓寬國內杧果的遺傳基礎，提高杧果種質資源利用率和育種效率。

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