頭花蓼種子生活力TTC法最優測定條件研究

王志威 魏升華 李俊 嚴福林 魏怡冰 杜富強 鄧嬌

摘 要 試驗研究用四唑染色法（TTC法）測定頭花蓼（Polygonum capitatum）種子活力的最優條件。以染色溫度、染色時間和TTC染色濃度為指標，通過單因素試驗、正交試驗、響應面試驗對頭花蓼種子活力測定的最優條件進行研究。結果：染色溫度40 ℃、染色時間180 min和TTC濃度20 mmol·L-1為頭花蓼種子活力測定的最優條件；三個檢測指標對種子活力測定影響的大小順序為染色溫度>染色時間>TTC染色濃度。認為TTC法是一種測量頭花蓼種子活力的有效方法，能夠快速客觀評價頭花蓼種子的發芽能力，為預測其播種量和出苗率提供科學依據和技術支持。

關鍵詞 頭花蓼；種子生活力；TTC染色法；最優測定條件

中圖分類號：S339.3+1 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.25.001

頭花蓼（Polygonum capitatum），又稱石莽草、石辣蓼、四季紅[1-2]，是蓼科蓼屬的多年生匍匐草本植物，入藥為其地上部分或干燥全草[3-4]。其味苦、辛，性涼；歸腎、膀胱經；功效清熱利濕，解毒止痛，活血散瘀，利尿通淋；主治痢疾、膀胱炎、尿路結石、腎盂腎炎等[5-6]。頭花蓼是我國西南地區民間常用傳統中草藥，也是該地區一種極為重要的苗藥[7-9]，在治療泌尿系統疾病等疾患上具有獨特的療效，目前是貴州威門藥業股份有限公司產品“熱淋清顆粒”的原藥材，同時也是“熱清淋膠囊”“四季草顆粒”和“泌淋膠囊”等的原材料[10-15]。頭花蓼除了藥用之外，因其植株覆蓋力較強，成片生長時觀賞性很好，故也是一種具有較大開發前景的觀賞性地被植物[16-18]。

近年來，有關頭花蓼的研究報道很多，但主要集中在其化學成分與藥理作用研究上。如張麗娟等（2012）對頭花蓼的黃酮類成分進行了研究，結果表明，頭花蓼中的黃酮類成分可能與其抗菌、抗炎活性相關，是頭花蓼的藥效物質基礎[19]；程欣霞等（2010） 采用高速逆流色譜技術對頭花蓼水提粉末的正丁醇粗提取物進行了分離純化，首次報道在頭花蓼中分離得到短葉蘇木酚酸[20]。

隨著頭花蓼中有效化學成分的大量發現及相關產品的大量開發，頭花蓼的市場需求也逐年增加，目前已逐漸從依賴野生資源采集轉為規范化和規模化種植[21]。由于種子種苗的質量是藥材產量和品質形成的重要基礎和前提[22]，因此頭花蓼種子的質量在種植過程中起著至關重要的作用。盡管發芽率是檢測種子質量的重要指標，但實踐證明頭花蓼的發芽時間較長，此法不能很好地滿足實際生產需要。四唑染色法（TTC染色法），是一種可快速測定種子活力的化學方法，是種子生產和貿易中的重要技術[23-25]。本研究使用TTC染色法，通過單因素試驗、正交試驗和響應面試驗，對頭花蓼種子活力測定的最優條件進行探討，以期為快速客觀評價頭花蓼種子的發芽能力、預測其播種量和出苗率提供科學依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

頭花蓼種子樣品于2016年9月采自貴州威門藥業股份有限公司頭花蓼資源圃，置于貴陽中醫學院種子庫4 ℃常溫庫保存備用。

1.2 試劑

2，3，5-氯代三苯基四氮唑，磷酸二氫鈉，氫氧化鈉，去離子水。

1.3 種子預處理方法

1.3.1 浸泡

挑選凈種子，將其放在奧林巴斯連續變倍體視顯微鏡下，用鑷子與解剖刀將種子的兩端切去一部分，使其胚兩端露出，之后將其放于置有濾紙的培養皿中，加去離子水浸泡種子，加水量以剛好沒過種子為宜，浸泡30 min使其吸脹后取出，將種子挑至另一置有濾紙的培養皿中。每個培養皿中放50粒種子，供染色用。

1.3.2 染色

在每個培養皿加入不同濃度的TTC溶液，溶液量以沒過種子為度，分別置于不同溫度的恒溫培養箱中避光染色，達到預設時間后取出，用去離子水沖洗后將種子放于濾紙上，根據種子染色面積的大小和程度判斷種子的活力。此外，另取50粒種子置于沸水中煮15 min后取出，并依據相同條件進行染色，作為對照組。每個處理重復3次。

1.4 種子活力最優測定條件試驗

1.4.1 單因素試驗

染色溫度：取頭花蓼種子50粒，TTC濃度為10 mmol·L-1，染色時間為60 min，分別置于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃溫度下染色，測定種子活力。

染色時間：取頭花蓼種子50粒，TTC濃度為10 mmol·L-1，染色溫度為30 ℃，染色時間分別為30 min、60 min、120 min、180 min、210 min，測定種子活力。

TTC濃度：取頭花蓼種子50粒，染色溫度為30 ℃，染色時間為60 min，分別置于濃度為5， 10， 15， 20， 25 mmol·L-1的TTC溶液中進行染色，測定種子活力。

1.4.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇染色溫度（A）、染色時間（B）和染色濃度（C）三個因素，每個因素三個水平，每組50粒頭花蓼凈種子，因素水平設定見表1。

1.4.3 響應面優化試驗

根據單因素試驗的結果，以染色溫度（A）、染色時間（B）、染色濃度（C）三因素為變量，以種子染色率（R）為響應值，根據Central-Composite中心組合試驗設計原理，設計三因素五水平的響應面試驗（見表2），每組50粒頭花蓼凈種子。

1.5 數據分析

采用SPSS 16.0和Design Expert 8.0.6軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由表3可知，頭花蓼種子的著色率隨著溫度的升高而升高，但從40 ℃以后著色率的增加趨于平緩，因此最適染色溫度在40 ℃左右；由表4可知，頭花蓼種子的著色率隨染色時間的增加而升高，當染色時間達到180 min時，種子著色率最高，當染色時間再增加時，種子著色率反而降低，因此最佳染色時間在180 min左右；由表5可知，頭花蓼種子著色率隨著濃度的升高而升高，但從染色濃度20 mmol·L-1之后著色率的增加趨于平緩，因此最適染色濃度在20 mmol·L-1左右。

2.2 正交試驗結果

由表6可知，頭花蓼種子活力最高（82%）的處理組合為：染色溫度40 ℃，染色時間180 min，TTC濃度20 mmol·L-1；種子活力最低（8%）的組合為：染色溫度30 ℃，染色時間60 min，TTC濃度10 mmol·L-1。方差分析結果（表7）顯示，染色溫度、染色時間和TTC濃度差異均不顯著，從三因素的P值及F值的大小可知，三因素對頭花蓼種子活力測定影響力大小順序為染色溫度>染色時間>TTC濃度。

2.3 響應面優化

2.3.1 模型的建立

用Design Expert 8.0.6軟件中的Central Composite Design對頭花蓼種子活力測定響應面試驗結果（見表8）進行多元回歸分析，得回歸方程為：

R=55.71+22.79a+18.03b+7.07c-4.00ab-5.50ac+10.00bc-3.42a2-8.01b2-2.35c2 （1）

方程（1）方差分析結果（見表9）：F=39.79，且P<0.000 1，表明模型具有極顯著性差異，在整個被研究的回歸區域內擬合較好。模型的決定系數為0.972 8，說明模型可以解釋響應值90.5%種子活力的變化，調整決定系數為0.948 4，與決定系數相差很小，表明模型擬合度高。模型的變異系數為13.71%（<15%），表明試驗具有可信度和精確度；試驗的信噪比為21.334（>4），較為合理，適用于頭花蓼種子活力測定優化試驗。模型系數的顯著性檢驗表明，a、b、c、bc、b2各項具有極顯著性，ac項具有顯著性，且三因素對頭花蓼種子活力測定的影響順序為染色溫度>染色時間>染色濃度，進一步支持了正交試驗的結論。

2.3.2 響應面分析及最佳優化條件的確定

響應面分析能直觀體現兩個因素交互作用對種子活力的影響，響應面的坡度越陡，則兩個因素的交互作用對種子活力響應值的影響越顯著。由圖1可知，染色溫度和染色時間交互作用時響應面的坡度最陡，其次是染色溫度和染色濃度，最后是染色時間和染色濃度，這進一步支持了正交試驗中的“三因素對頭花蓼種子活力測定值影響順序為染色溫度>染色時間>染色濃度”的結論。用Design Expert 8.0.6軟件中的Central Composite Design分析，得出頭花蓼種子最優測定條件為：染色溫度40 ℃，染色時間180 min，染色濃度20 mmol·L-1，此預測的條件與正交試驗的結果一致。

3 結論和討論

采用TTC染色法對常用苗藥頭花蓼的種子進行了活力最優測定條件研究，總結和討論于下。

1）染色溫度、染色時間和TTC染色濃度均為活力測定的關鍵因素，三者中的某一者或二者互作均會對頭花蓼種子活力測定產生影響。類似的情況同樣存在于其他藥用植物種子活力TTC法測定的研究結果中，如：張瑜等（2013）對豬屎豆種子進行TTC染色的研究發現，TTC濃度、染色溫度和染色時間影響豬屎豆種子的染色效果[26]；成小璐等（2016）對羊耳菊的種子活力測定發現，TTC濃度、染色溫度和染色時間為羊耳菊種子活性的三條重要檢測指標[24]。

2）三因素對頭花蓼種子活力測定影響的大小順序為染色溫度>染色時間>TTC濃度。從實際生產需要出發，由于TTC和溫度都存在價格成本，因此可依據本文中的結論，適當降低染色溫度或TTC濃度，而通過延長染色時間從而達到節約成本的目的。

3）本研究同時運用正交法和相應面法結果進行數據分析，結論均表明，頭花蓼種子活力TTC測定的最優條件為：染色溫度40 ℃，染色時間180 min，TTC濃度20 mmol·L-1。響應面法能考察各因素間的相互作用，精密度較高，在研究上和正交試驗一起使用，可彌補正交試驗的不足。如：在優化丹參提取工藝時，李紹林等[27]用正交法，以提取次數、提取時間、醇濃度和溶媒量作為考察因素，發現只有提取次數對結果具有顯著性影響；而黃元紅等[28]用響應面法得到4個因素影響均較顯著，并結合回歸方程和響應面結果最終確定其最佳工藝條件。成小璐等（2016）[24]對羊耳菊種子活性的TTC法檢測研究發現，和正交試驗法相比較，響應面分析法在試驗設計和結果表達方面更加優良，能進一步確定并彌補正交試驗的結果。因此，筆者認為，在種子活力TTC法檢測的過程中，為了保證數據結果的科學性，可同時考慮運用正交法和響應面法。

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（責任編輯：丁志祥）