HPLC法測定保健食品中葉黃素含量

周立梅 楊磊 張金秋

摘要 [目的]建立改良的HPLC-C18法測定保健食品中葉黃素含量。[方法]優化樣品前處理方法，通過單因素考察對破囊溶劑種類、破囊時間、提取時間、提取溶劑進行優化，采用常規HPLC-C18分析方法進行測定。色譜條件為：流動相甲醇，流速1.0 mL/min，檢測波長446 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。[結果]葉黃素在0.139 6～2.094 0 μg/mL與峰面積線性關系良好，平均回收率為99.55%， RSD為2.21%。[結論]改良后的方法操作簡便、準確、穩定，所用試劑綠色環保，可用于保健食品中葉黃素含量測定。

關鍵詞 高效液相色譜；保健食品；葉黃素；含量測定

中圖分類號 TS207.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）20-0164-03

Abstract [Objective]The research aimed to establish an improved HPLCC18 method for the determination of lutein in health foods.[Method]Optimization of sample pretreatment method，using single factor to optimize in four aspects，the type of solvent to splitting microcapsules，time of splitting microcapsules，time of extraction and solvent extraction.The extractive was analyzed by conventional HPLCC18.HPLC conditions：mobile phase was methanol，mobile phase rate was 1.0 mL/min，detection wavelength was 446 nm，oven temperature was 30 ℃，injection volume was 20 μL.[Result]Lutein had good linear relationship within the range of 0.139 6-2.094 0 μg/mL，the average recovery was 99.55%，the RSD was 2.21%.[Conclusion]The improved method is easy to operate，accurate and stable，the solvent is environment friendly for quantitative analysis of lutein from the health food.

Key words HPLC；Health food；Lutein；Determination of content

葉黃素屬于含氧類胡蘿卜素，主要存在于深綠色蔬菜（菠菜、羽衣甘藍等）、蛋黃、玉米、柑橘類等水果中，人體不能直接合成。越來越多流行病學和臨床試驗表明，膳食或血清中較高含量的葉黃素可降低眼部疾病患病風險[1]。作為生理活性物質，葉黃素在醫學和功能食品領域具有廣闊的研究開發前景[2]。

目前，利用HPLC法測定保健食品中葉黃素含量的方法有2種，一種是以C30為分離色譜柱的測定方法[3]，另一種是黨亞敏等[4]以C18為分離色譜柱的測定方法，其中C30分離色譜柱使用不廣泛。測定葉黃素的色譜條件相對成熟，但是樣品處理方法很多，如無水乙醇超聲提取法[4]、石油醚超聲提取法[5]、水提正己烷—乙酸乙酯萃取法[6]等。為保證樣品中葉黃素被充分提取，該研究在優化破囊溶劑、提取溶劑和提取時間的基礎上，采用HPLC-C18法測定保健食品中葉黃素含量。

1 材料與方法

1.1 試材

葉黃素原料，荷蘭帝斯曼集團；樣品來源于吉林省現代中藥工程研究中心有限公司；葉黃素對照品，Sigma公司；甲醇，色譜純，Fisher Scientific；其余所用試劑均為分析純。

1.2 儀器 UitiMate3000液相色譜儀，ACE C18色譜柱，美國ACE公司；ULtra-6100紫外可見分光光度計，北京普源精電科技有限公司；AB135-S電子天平，梅特勒-托利多集團公司；SB-1200D型數控超聲波清洗機，寧波新芝生物股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件。ACE C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱，流動相為甲醇，流速為1.0 mL/min，葉黃素檢測波長為446 nm，柱溫30 ℃，進樣量為20 μL。

1.3.2 對照品溶液的制備。

1.3.2.1 標準儲備液。準確稱取5 mg（精確至0.01 mg）葉黃素標準品，以0.1%BHT（二丁基羥基甲苯）乙醇溶液溶解并定容至100 mL。該標準儲備液充氮避光置于-20 ℃或以下的冰箱中可保存6個月。

1.3.3 樣品溶液的制備。精密稱取樣品0.1 g，置25 mL棕色容量瓶中，加入60 ℃水5 mL，超聲處理3 min，取出，放冷，加入0.1% BHT乙醇溶液至接近刻度，未定容，繼續超聲處理10 min，取出，放冷，用0.1%BHT乙醇溶液定容至刻度，搖勻。精密吸取5 mL至100 mL容量瓶中，用0.1%BHT乙醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，供液相測定[7]。

1.3.4 單因素試驗。

1.3.4.1 破囊溶劑的選擇。在檢測微膠囊型葉黃素的過程中，至關重要的一點是對待檢樣品進行前處理，根據文獻和相關資料[4，7-8]，對N，N—二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、60 ℃水3種破囊溶劑進行考察。精密稱取樣品0.1 g，置25 mL棕色容量瓶中，加入60 ℃水5 mL，超聲處理5 min，取出，放冷，加入無水乙醇至刻度，搖勻。精密吸取5 mL至100 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，供液相測定。

1.3.4.2 破囊時間的選擇。因本品所用原料為葉黃素微囊，破囊時間的確定對含量測定十分必要，該研究分別考察了破囊時間為3、5、7 min時原料和樣品的含量。

1.3.4.3 提取時間的選擇。為保證樣品中葉黃素溶出后被充分提取，需對葉黃素的提取時間進行了考察。分別考察了提取時間為5、10、15 min時原料和樣品的含量。

1.3.4.4 提取溶劑的選擇。在參考文獻[8]的基礎上，分別對提取溶劑0.1%BHT無水乙醇溶液和無水乙醇進行考察，在0、2、4、8、12、18、24 h進樣測定，測定葉黃素含量。

1.3.5 方法學考察。

1.3.5.1 標準曲線和線性范圍。從葉黃素標準儲備液中準確移取0.05、0.10、0.20、0.40、1.00 mL溶液至5個25 mL棕色容量瓶中，用0.1%BHT乙醇溶液定容至刻度，得到濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、2.0 μg/mL的系列標準工作液。標準工作液充氮避光置于-20 ℃或以下的冰箱中可保存1個月。在“1.3.1”色譜條件下，以對照品溶液濃度為橫坐標、測得的峰面積為縱坐標， 繪制標準曲線。

1.3.5.2 精密度試驗。精密吸取“1.3.4.1”項下方法制備的含葉黃素0.4 μg/mL的對照品溶液20 μL，按“1.3.1”色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。

1.3.5.3 重復性試驗。精密稱取樣品6份，按“1.3.3”項下方法平行制備樣品溶液，在“1.3.1”色譜條件下進樣，測定樣品中葉黃素的含量。

1.3.5.4 穩定性試驗。精密吸取同一樣品溶液，于制備后的0、2、4、8、12、24 h，在“1.3.1”色譜條件下進樣，記錄峰面積。

1.3.5.5 加樣回收率試驗。分別精密稱取6份已知含量的樣品0.050 0 g，置25 mL棕色容量瓶中，再分別精密加入葉黃素對照品溶液（濃度為0.716 7 mg/mL）2.0 mL，加入60 ℃水5 mL，超聲處理3 min，取出，放冷，加入0.1%BHT乙醇溶液至接近刻度，未定容，繼續超聲處理10 min，取出，放冷，用0.1%BHT乙醇溶液定容至刻度，搖勻。精密吸取5 mL至100 mL容量瓶中，用0.1%BHT乙醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，在“1.3.1”色譜條件下進樣，測定樣品中葉黃素的含量，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 破囊溶劑的選擇。從表1可看出，二甲基亞砜和60 ℃水轉移率合理，破囊效果無明顯差異，考慮到二甲基亞砜刺激眼睛、呼吸系統和皮膚，水無毒、綠色環保，故選擇60 ℃水作為破囊溶劑。

2.1.2 破囊時間的選擇。從表2可看出，破囊時間為3和5 min 時，原料和樣品含量無明顯差異；破囊時間為7 min時，原料和樣品含量有所下降。從操作簡單、耗時短方面考察，確定破囊時間為3 min。

2.1.3 提取時間的選擇。

從表3可看出，超聲時間過長會造成原料和樣品含量降低，超聲時間為10 min時，原料和樣品含量較合理。

2.1.4 提取溶劑的選擇。無水乙醇穩定性試驗結果（表4）顯示，葉黃素含量的RSD為4.60%，表明無水乙醇樣品溶液在24 h內不穩定。0.1%BHT乙醇溶液穩定性試驗結果（表4）顯示，葉黃素含量的RSD為1.86%，表明0.1%BHT乙醇溶液樣品在24 h內穩定。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察。

以對照品溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得出線性方程為：Y=5.110 9X-0.063 6（R2=0.999 9）。表明葉黃素在0.139 6～2.094 0 μg/mL與峰面積線性關系良好。

2.2.2 精密度試驗。從表5可看出，葉黃素峰面積的相對標準偏差RSD為1.76%，表明儀器精密度高。

2.2.3 重復性試驗。從表5可看出，葉黃素含量的RSD為1.54%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗。從表6可看出，葉黃素的平均回收率為99.55%，RSD為2.21%，表明葉黃素的加樣回收率良好。

3 結論與討論

該研究測定葉黃素是在黨亞敏等[4]研究的基礎上進行了優化，分別考察了N，N—二甲基甲酰胺[4]、60 ℃水[7]、二甲基亞砜[8]3種破囊溶劑，確定了破囊溶劑為60 ℃水，與其他2種破囊溶劑比較，轉移率最為合理且無毒、綠色環保；對樣品提取溶劑進行了優化，在無水乙醇的基礎上增加了0.1%BHT[8]，樣品溶液中葉黃素在24 h很穩定，解決了葉黃素在測定過程中不穩定的缺點；對破囊時間、提取時間進行優化和方法學考察，確定破囊時間為3 min，提取時間為10 min，此條件下葉黃素可被充分提取。綜上所述，該方法操作簡便、適用性強、重現性好、穩定性佳，所用試劑綠色環保，此方法可用于保健食品中葉黃素含量測定。

參考文獻

[1] 李大婧，龐慧麗，劉春泉.葉黃素和玉米黃質對眼睛的保護作用研究進展[J].江蘇農業科學，2013，41（9）：1-4.

[2] 李大婧，劉春泉，白云峰，等.葉黃素、玉米黃質研究進展：葉黃素、玉米黃質的結構、性質和生物學功能[J].核農學報，2006，20（1）：64-67.

[3] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.食品中葉黃素的測定：GB 5009.248—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[4] 黨亞敏，李建平，張明月，等.高效液相色譜法測定保健食品中的葉黃素[J].中國衛生檢驗雜志，2011，21（7）：1650-1651.

[5] 黃聲嵐，俞曉玲，柯加法，等.高效液相色譜法測定食品中的葉黃素[J].海峽預防醫學雜志，2009，15（4）：48-50.

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[7] 白鴻.保健食品功效成分檢測方法[M].北京：中國中醫藥出版社，2011：258-261.

[8] 魯杰，方從榮，高潔，等.微膠囊化功能性番茄紅素產品的高效液相色譜測定法改進[J].中國食品添加劑，2013（3）：99-102.