熒光定量PCR技術的原理及其在植物研究中的應用

黃小玲　張登　廖嘉明

摘要實時熒光定量PCR技術，因其具有操作簡單、重復性好、靈敏度高、定量準確、速度快等優點，已廣泛應用于分子生物學研究的多個領域。對實時熒光定量PCR技術的原理、定量方法以及在植物研究中的應用等進行概述，以促進該技術的應用。

關鍵詞實時熒光定量PCR；原理；應用

中圖分類號S126文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）25-0036-05

Principles and Applications of Fluorescent Quantitative PCR in Plant Research

HUANG Xiaoling， ZHANG Deng， LIAO Jiaming et al

（Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm， College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agriculture University， Guangzhou，Guangdong 510642）

AbstractRealtime fluorescence quantitative PCR technology has been widely used in many fields of molecular biology research due to its advantages of simple operation， good repeatability， high sensitivity， accurate quantitation and high speed. Principle，quantitative methods and applications in plant research of realtime fluorescence quantitative PCR technology were reviewed to promote its application.

Key wordsRealtime quantitative PCR；Principles；Application

自從1985年Saiki等[1]發明聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）以來，PCR技術很快成為科研、臨床診斷的熱點技術。但傳統PCR技術在應用中一是不能準確定量，二是容易交叉污染，產生假陽性。直到1992年，日本Higuchi等[2]首次采用動態PCR方法和封閉式檢測方式對目的核酸數量進行定量分析，首次提出熒光定量PCR技術的概念。當時他使用EB（溴化乙錠）作為熒光標記染料，采用一臺經過改良的熱循環儀，用UV射線照射樣品，然后通過CCD相機檢測產生的熒光值，利用PCR反應中的數學函數關系，再結合加入標準品的方法，達到對檢測樣品進行準確定量的目的。但由于這種方法實驗儀器昂貴，一些非特異的PCR產物同樣能被檢測到并包含在被測的熒光信號值總量之中而導致定量不準確等因素，最終使這種試驗技術在當時沒能成為主流的試驗技術。

1995年美國PE公司成功研制TaqMan技術，1996年又推出首臺熒光定量PCR檢測系統，通過檢測每個循環的熒光強度，并使用Ct值進行分析，熒光定量PCR才很快得到大家的接受，并廣為應用。

1RT-qPCR技術的原理

實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）是通過對PCR擴增反應中每個循環產物熒光信號的實時檢測，從而實現對起始模板的定量及定性分析。在實時熒光定量PCR反應中，引入一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。一般而言，熒光擴增曲線可分為3個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加。PCR的終產物量與起始模板量之間無線性關系，所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。該技術不僅實現對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無污染性、實時性和準確性等特點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域[3-6]。

2RT-qPCR的分類

熒光定量PCR使用的熒光化學可分為2種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量PCR的方法相應的可分為特異類和非特異類2類，特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物；而非特異性檢測方法是在PCR反應體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射出熒光信號。前者由于增加探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行，并且價格較低。

2.1SYBR Green Ⅰ

SYBR Green Ⅰ 是一種能與雙鏈DNA結合發光的熒光染料。其與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。SYBR Green Ⅰ 的最大吸收波長約為497 nm，發射波長最大約為520 nm。由于SYBR Green Ⅰ沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會結合發光，對PCR反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會有假陽性發生。但它能與所有的雙鏈DNA相結合，所以對不同模板不需要特別定制不同的特異的探針，通用性較好，并且價格相對較低，因此國內外在科研中使用比較普遍。

2.2水解探針（Taqman）

Taqman探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5末端，而淬滅劑則在3末端。當探針與靶序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3端的淬滅劑接近而被淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的5外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅劑分離，發射熒光。一分子的產物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此，Taqman探針檢測的是積累熒光。

2.3雜交探針（Beacon、FRET）

分子信標（molecular beacon）是一種呈發夾結構的頸環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。熒光基團被激發后產生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團產生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標的頸環結構中，環一般為15～30個核苷酸長，并與目標序列互補：頸一般為5～7個核苷酸長，并互相配對形成頸的結構。熒光基團標記在探針的一端，而淬滅劑則標記在另一端。在復性溫度下，因為模板不存在時形成頸環結構，當加熱變性會互補配對的頸環雙鏈解開，如果有模板存在，環序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標將成鏈狀而非發夾狀，使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發時，因淬滅作用被解除，發出激發光。由于是酶切作用的存在，分子信標也是積累熒光。常用的熒光基團有FAM和Texas Red。

FRET探針又稱雙雜交探針，FRET探針由2條相鄰探針組成，當退火時，在一條探針的5端標記FAM和在另一條探針的3端標記Red640基團相鄰，激發FAM產生的熒光，作為Red640基團的激發光被吸收，使Red640發出波長為640 nm的熒光。當變性時，探針游離，兩基團距離遠，不能產生640 nm波長的熒光。由于FRET探針是靠近發光，所以檢測信號是實時信號，非積累信號。常用的熒光基團有LC-Red640、LC-Red705。

3RT-qPCR的定量方法

在實時熒光PCR中，模板的定量有2種方法：絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過已知的標準曲線來確定我們所感興趣基因的拷貝數；相對定量指在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列的量的變化。

3.1絕對定量

絕對定量RT-qPCR一般采用外標準品定量的制備來實現絕對定量。而標準樣品的種類有含有與待測樣品相同擴增片段的克隆質粒、含有與待測樣品相同擴增片段的cDNA或PCR的產物。將標準品稀釋成不同濃度的樣品，并作為模板進行PCR反應。以標準品拷貝數的對數值為橫坐標，以測得的ct值為縱坐標，繪制標準曲線。對未知樣品進行定量時，根據未知樣品的ct值，即可在標準曲線中定出樣品的拷貝數。絕對定量具有穩定、準確等優點，因此在很多文獻中已有報道[7-11]。

3.2相對定量

相對定量是指在測定目的基因的同時測定某一內源性管家基因，采用靶基因與內源對照基因的表達比值來標準化結果[12-14]。在定量PCR中，為了去除不同樣本在RNA產量、質量和反轉錄效率上可能存在的差別而獲得目標基因特異性表達的真正差異，通常選擇內參基因進行校正和標準化[15-19]。定量PCR結果的準確性在很大程度上取決于穩定內參基因的選擇。目前，Vandesompele等[20]、Andersen等[21]、Pfaff1等[22]分別編寫GeNorm、NormFinder和BestKeeper程序用于比較內參基因的表達變化和穩定性，并且GeNorm程序得到進一步改進[23]。

4MIQE指導方針

目前，對如何更好地進行和解釋定量PCR試驗缺少一致的意見。且由于缺少足夠的試驗細節描述而進一步惡化，從而妨礙讀者對試驗結果的精密評價和試驗的重復。因此，Bustin等[24]于2009年提出MIQE指導方針（The Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments，MIQE）。MIQE是一套評估定量PCR試驗描述的最低需要的指導方針，包括樣品的獲取、試驗設計驗證以及數據分析等方面。MIQE指導方針旨在于為試驗結果提供可靠性，從而確保科學文獻的真實性、促進實驗室之間的一致性以及提高試驗的透明度。非定量PCR專業人士對于MIQE指導方針眾多試驗關聯細節的詳盡描述感到繁瑣和畏懼，使得已建立的試驗常規報告變得復雜。為此，Bustin等[25]于2010年提出一套簡約版的指導方針——MIQE概要，覆蓋每個定量PCR試驗的主要參數。按照MIQE的指導方針，完全公布試驗試劑、序列以及數據分析方法能更好地使其他研究者重現試驗結果[24]。

安徽農業科學2018年

5實時熒光定量PCR在植物研究中的應用

定量RT-PCR技術主要用于基因表達的定性和定量檢測，其自問世以來在基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等領域取得較大的成績[26]。雖然在植物研究方面應用起步較晚，但目前在植物學研究中的應用越來越廣泛，如植物營養學研究、植物發育學研究、植物抗逆機理研究、轉基因植物的檢測、病原菌的檢測、植物與微生物互作機理研究、植物抗病性檢測、信號轉導、環境對植物基因表達的影響等方面[27]。

5.1基因差異表達分析

植物的生長、發育、分化和衰老涉及許多基因的時空順序表達，因此，研究這個過程中基因表達的變化是揭示生長發育機理的重要手段。RT-qPCR技術是研究植物基因表達水平變化的一項重要技術[27]。Farzad等[28]利用RT-qPCR技術研究角堇（Viola cornuta cv.）的3個花青苷生物合成基因查爾酮合酶基因（CHS）、二氫黃酮醇4-還原酶基因（DFR）和花色素合酶基因（ANS）在花的3個不同發育時期的表達差異，并且把角堇確立為研究自然條件下基因調控花顏色改變的新模式系統。Harada等[29]在康乃馨開花的過程中，研究與花瓣的生長和發育相關基因的表達，熒光定量分析顯示4個木葡聚糖內傳糖苷酶/水解酶基因XTH（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）和3個擴展蛋白基因EXP（expansin，EXP）在康乃馨的綠色營養器官、花瓣、柱頭以及花柱的不同部位存在差異表達，并且發現在不同的發育時期，這7個基因在花瓣中的表達也有差異。結果表明DcXTH2、DcXTH3、DcEXPA1和DcEXPA2在康乃馨花開放的過程中與花瓣的生長發育有關。Wang等[30]利用熒光定量PCR研究EXP基因在杉木各個不同部位的表達情況，發現ClEXPA1、ClEXPA2 2個基因在形成層中存在特異表達，并結合轉基因煙草研究，表明這2個基因通過直接或間接影響纖維素的新陳代謝參與植物的生長發育。

5.2植物病理學研究

植物抗病性及其機制研究一直是當今植物病理學和植物抗病育種中的熱點和焦點問題[31]。RT-qPCR技術可以用于研究病原菌感染宿主植物的過程中，宿主植物基因表達的改變以及抗病植株與感病植株的基因表達的差異，為植物抗病機理的研究和抗病品種的選育提供理論依據[27]。到目前為止，RT-qPCR技術已在水稻[32-34]、玉米[35-37]、小麥[38-39]、大麥[40-42]、大豆[43]、豌豆[44]、黃瓜[45]、橙[46]、花生[47]、油菜[48]、葡萄[49]、蘋果[50]、辣椒[51]、楊樹[52]、云杉[53]等植物中廣泛應用。

5.3外源基因拷貝數分析

植物轉基因研究中，外源基因在植物基因組中的拷貝數為1～2個時能夠較好表達，插入拷貝數較多時會導致表達不穩定，甚至發生基因沉默現象[54]。因此，T0代轉基因外源基因的拷貝數是研究植物轉基因分子特性的基礎步驟之一[26]。Southern-blot方法是鑒定轉基因拷貝數的傳統方法，但其具有操作繁瑣、試劑昂貴、樣品需要量大等缺點，使得研究人員消耗太多的人力、物力。實時定量PCR法克服了Southern blot的定量缺點，已被廣泛應用于DNA的定量檢測。Mason等[55]利用TaqMAN探針熒光定量PCR技術檢測轉基因番茄的目的基因的1、2、3拷貝數，并且與通過Southern blot分析所得的結果進行比較，發現前者所獲信息的質量比后者更高。Yi等[56]利用熒光定量PCR技術，以單拷貝基因GhUBC1為內參，對轉基因棉花的28個T0代株系的拷貝數進行成功檢測，并且有效地從T1代的轉基因群體中鑒定出純合子。然而，由于轉基因常常伴隨著嵌合體的出現[57-58]，而熒光定量PCR技術也可用于嵌合體的檢測[59]。

5.4植物病菌、病原微生物及害蟲檢測

植物病菌或病原微生物常常能引起多種農作物、園林觀賞、經濟作物及牧草發生病害。傳統的檢測方法主要是采用生物學和血清學方法，費時又費力。自從實時熒光定量PCR技術應用于植物病菌的檢測之后，不僅有效地提高檢測速度和水平，而且檢測的靈敏度也比一般的檢測方法高出100倍左右。還有一個明顯的優點是試驗中不需要PCR的后續處理及病原菌的分離培養，大大簡化試驗操作步驟，縮短檢測時間[60]。自2002年Frederick首次將該方法應用于植物病原真菌的檢測[61]，國內外已出現大量利用該技術檢測病原菌的報道[62-67]。

目前，實時定量PCR技術應用于植物害蟲鑒定、防治等研究相對其他領域較少，但該技術在植物害蟲、植物病原線蟲[68-70]和害螨[71]研究中已經顯示出極好的應用前景[72]。傳統的植物害蟲鑒定方法依賴于形態特征和寄主范圍等特征來區分，但是對于一些植物害蟲之間的區分比較困難，尤其是檢疫性植物害蟲實蠅類[73]、薊馬類[74-75]等，而實時定量PCR技術是解決這一問題的可靠手段[72]。

5.5轉基因植物鑒定

隨著現代生物技術的發展，轉基因食品已逐步進入普通百姓的生活。轉基因食品特別是水稻、小麥、玉米等主要糧食作物的轉基因品種往往具有高產、優質、抗病蟲害的特點[31]。但在解決人類面臨的糧食和能源危機的同時，也帶來新的問題，如生態問題，轉基因食品對人類健康的危害等，因此，對轉基因產品的檢測和定量是大家關注的焦點[26]。

熒光定量PCR技術已成為轉基因產品快速靈敏檢測的技術途徑，并被廣泛使用[76-78]。根據目前轉基因技術中使用的基因構件主要來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子和NOS終止子，絕大部分轉基因產品含有這2個基因片段，用檢測定量這2個片段就可達到簡便、快速、準確地確定是否為轉基因產品[79]。

6前景

目前，實時熒光定量PCR技術還廣泛應用于植物營養學研究、植物發育學研究、植物抗逆機理研究、植物與微生物互作機理研究、植物抗病性檢測、信號轉導、環境對植物基因表達的影響等方面[27]。近年來，許多科研工作者基于熒光PCR的基本原理對熒光PCR技術進行不斷深入地研究和改進，使熒光PCR技術得到進一步的完善，并在此基礎上開發出許多新的熒光定量PCR技術。隨著科學技術的不斷發展，儀器設備和試劑費用的降低及相關知識的普及，RT-qPCR技術將成為分子生物學實驗室必備的研究工具，將會廣泛應用于植物研究各領域。

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