銀納米粒子比色傳感器法測定食品及水樣中雙酚A

顧翔源 張瑞 姜峰 賈睿 王軍 朱穎越

摘要 [目的]研究一種基于銀納米粒子聚集使體系顏色發生改變的原理，建立新的生物傳感器檢測食品中的雙酚A。[方法]采用檸檬酸還原法合成銀納米粒子并修飾核酸適配體。雙酚A 與核酸適配體結合發生變構效應導致銀納米粒子聚集，其特征峰以及顏色發生變化，研究體系特定波長吸光度比值與雙酚A濃度的變化關系。[結果]在最佳優化條件下，該比色法在質量濃度為0.50～50.00 ng/mL呈現良好的線性關系，檢出限為0.3 ng/mL。將該檢測體系應用于BPA類似物的檢測，特異性較好。[結論]該方法對食品中雙酚A的檢測有一定的應用前景。

關鍵詞 銀納米粒子;鹽誘導;核酸適配體;雙酚A

中圖分類號 TB487文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0179-02

雙酚A（BPA），是一種重要的化工有機原料，苯酚和丙酮的衍生物，用于合成環氧樹脂、聚砜樹脂、聚碳酸酯等高分子材料，也用于增塑劑、抗氧化劑、熱穩定劑等化工產品。然而最受關注的是雙酚A對于人類的影響[1-2]，它可通過各類食品包裝材料、奶瓶、水杯、餐具，甚至是最常見的水滲入人體，作為一種環境內分泌干擾物造成人中樞、生殖、心血管系統的癌變[3-4]。為了保證食品及水樣的安全，對其中BPA殘留檢測方法的研究具有重大意義。

目前，環境水樣中BPA的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法[5-7]、酶聯免疫法[8]、分光光度法、熒光法、電化學法等[9-12]。這些方法在準確度上雖然有一定優勢，但由于樣品前處理時間長、對儀器要求高、操作復雜、經濟成本高，一種新型快速有效的雙酚A檢測方法亟待被開發。

自從BPA對應的核酸適配子被篩選出來后，相較于免疫學測定方法，核酸配子具有抗體的特異性和敏感性，合成方法比抗體更加簡單，在許多相關文獻中已有利用BPA核酸適配子檢測BPA的記錄[13-15]。筆者利用鹽對銀納米粒子的誘導聚集效應，利用具有特異性的單鏈DNA、鹽、BPA之間的相互作用，構建一種新型生物傳感器，靈敏高效地檢測食品及水樣中雙酚A的含量。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑 硝酸銀（AgNO3）、二水合檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）、氯化鈉（NaCl）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均為分析純，購買于江蘇強盛功能化工股份有限公司;BPA及其類似物，分析純，購買于上海百靈威科技;試驗用水均為超純水。BPA核酸適配子ssDNA，其序列為5-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3，購買于上海生工公司。

1.2 試驗儀器 UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津公司;旋渦振蕩器，美國ScientificIndustries公司;密理博超純水儀，北京普析通用公司。

1.3 銀納米粒子溶液的合成

將100 mL超純水配制的0.01% AgNO3溶液裝入錐形瓶中，加入磁力攪拌子，置于恒溫電磁攪拌器上加熱，沸騰持續2 min后迅速加入2.5 mL質量分數為1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續攪拌加熱至溶液變為淡黃色，生成銀納米粒子，繼續加熱10 min后停止加熱，攪拌使其冷卻至室溫，放置在4 ℃環境中貯存備用。

配制過程中所用磁力攪拌子、玻璃器皿等均預先以王水浸泡過夜。

1.4 試驗原理

銀納米粒子在鹽誘導下會發生聚集，引起明顯體系吸光度的改變。具有負電性磷酸骨架的特定結構的ssDNA可以通過靜電吸引結合在銀納米粒子表面，使銀納米粒子分散，而且ssDNA與雙酚A反應形成變構效應，其間結合力大于DNA與銀納米表面的電荷吸附效應。當體系中NaCl與ssDNA比例恰好維持銀納米平衡時，其吸光度保持不變，在加入BPA后，ssDNA從銀納米粒子上剝離下來與BPA結合，使銀納米粒子暴露在鹽環境中，繼而在鹽誘導下，銀納米粒子發生不同程度聚集，溶液顏色改變，由黃色變為灰色，吸光度隨著BPA濃度改變而改變，銀納米粒子特征峰位置和強度發生變化。基于這個原理，設計出一種新型生物傳感器應用于BPA的檢測。

1.5 試驗方法 向2 mL離心管中加入150 μL用緩沖液（20? mmol/L ThrisHCl，pH 7.4）配制的ssDNA溶液（終濃度為8 nmol/L），再加入1 200 μL銀納米粒子溶液混勻，室溫放置過夜后，加入NaCl溶液（終濃度為40? mmol/L），混勻后加入100 μL不同濃度的BPA，總定容為1 500 μL，室溫放置3 min，在波長300～700 nm掃描其吸光光譜。

2 結果與分析

2.1 試驗條件的優化

影響試驗結果的因素包括NaCl濃度和ssDNA濃度，確定兩者最適濃度可以確定檢測方法的最佳結果。在銀納米溶液中加入不同濃度的NaCl溶液，引起銀納米粒子的聚集，使得A608/A418值不同。由圖1可知，當控制NaCl體系濃度在40 mmol/L時，A608/A418值最大，銀納米粒子聚集程度最大。繼續增加濃度，比值幾乎不變。在此基礎上，同理，可測得ssDNA體系濃度為8 nmol/L時，A608/A418值最小，銀納米粒子分散程度最大。由此可知，NaCl和ssDNA最佳濃度分別為40 mmol/L和8 nmol/L。

2.2 BPA標準曲線的測定

在試驗條件最優的情況下，利用建立的傳感器檢測不同濃度梯度的BPA溶液（0.01、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00 ng/mL），利用分光光度計對體系吸光度進行測量。從圖2～3可看出，隨雙酚A濃度變化，溶液A608/A418值呈現上升趨勢，且在BPA濃度為0.50～50.00 ng/mL呈現出線性變化，線性方程為 Y =0.146+0.013 4 X，線性相關系數為0.998 ?檢測限可達0.30 ng/mL。

2.3 特異性分析

為了排除其他類似物對雙酚A檢測的干擾，取BPA類似物雙酚B（BPB）、雙酚C（BPC）、己烯雌酚（DES），利用建立的傳感器進行測量。在4種物質濃度都為相同濃度（50 ng/mL）時掃描吸光度，結果如圖4，通過比較分析，除了雙酚A體系顏色由黃色變為灰色，且吸光度比值變化較大，其他體系幾乎沒有變化。

2.4 實際樣品的檢測

為測試建立的傳感器的實際應用效果，利用純凈水加入不同量的雙酚A標準品制成不同濃度的樣品，用此法檢測樣品中BPA含量。由表1可知，測量的回收率為96%～106%，表明該方法可以用于水中雙酚A的檢測。

3 結論

基于一定鹽濃度導致銀納米粒子聚合而使得吸光度發生較大變化和具有優異特性的核酸適配子，建立一種能快靈敏地檢測水樣中雙酚A的比色傳感器。在優化條件下，定量定性檢測結果較好，并具有高選擇性和特異性。與傳統檢測方法相比，此方法快速、靈敏、操作方便，有較好的應用前景。

參考文獻

[1]CHAPIN R E，ADAMS J，BOEKELHEIDE K，etal.NTPCERHR expert panel report on the reproductive and developmental toxicity of bisphenol A[J].Developmental and reproductive toxicology， 2008， 83（3）：157-395.

[2]金嶺，董文麗，孫智慧.聚碳酸酯中雙酚A的毒性及遷移規律研究進展[J].包裝工程，2013，34（9）：122-126.

[3]LE CORRE L，DEL MORAL L I，BESNARD P，et al.Bisphenol A disrupts the intestinal lipid metabolism[J].Toxicology letters，2012，211：210.

[4]張平，鄧正棟，程婷婷，等.水樣中雙酚A檢測技術研究[J].中國環境監測，2008，24（6）：11-17.

[5]賴鶯，王鴻輝，蔡鷺欣，等.高效液相色譜法測定環氧樹脂粘接劑中的雙酚A [J].分析試驗室，2012，31（3）：43-46.

[6]焦艷娜，丁利，李暉，等.加速溶劑萃取-GC-MS/MS 法測定食品接觸材料中雙酚A、雙酚F 及其衍生物的殘留量[J].包裝工程，2011，32（15）：53-57.

[7]衛碧文，繆俊文，宇文佳.氣相色譜—質譜法分析食品包裝材料中雙酚A[J].分析試驗室，2009，28（1）：107-109.

[8]李月明，張磊，周麗華，等.酶聯免疫法檢測食品中的雙酚A殘留[J].食品研究與開發，201 33（6）：131-133，150.

[9]王玉春，劉趙榮，弓巧娟.電化學分析法對食品包裝材料中雙酚A的檢測[J].食品科學，2010，31（20）：303-306.

[10]孫希嵐，朱爭禮，單營營，等.食品金屬罐用涂層中雙酚A的快速定性分析方法[J].包裝工程，2013，34（1）：38-43.

[11]羅敏，張吉坪，李晨曦，等.食品容器中雙酚A的一種現場檢測方法[J].包裝工程，2014，35（15）：11-14.

[12]余建，宋緊東，蔣小良.環境水樣中雙酚A檢測與分析方法的研究進展[J].日用化學品科學，2014（4）：32-36，45.

[13]JO M，AHN J Y，LEE J，et al.Development of single-stranded DNA aptamers for specific bisphenol A detection[J].Oligonucleotides，2011，21（2）：85-91.

[14]MEI Z L，CHU H Q，CHEN W，et al.Ultrasensitive one-step rapid visual detection of bisphenol A in water samples by label-free aptasensor[J].Biosensors and bioelectronics，2013，39（1）：26-30.

[15]KUANG H，YIN H H，LIU L Q，et al.Asy mmol/Letric plasmonic aptasensor for sensitive detection of Bisphenol A[J].ACS Applied Materials & Interfaces，2013，6（1）：364-369.