甘薯黑斑病菌快速大量產孢方法研究

王波 黃忠勤 丁震乾 常勇 周澗楠 蘇在興 周興根

摘要 [目的]建立甘薯黑斑病菌快速大量產孢體系，為甘薯黑斑病品種抗性鑒定以及藥劑生物測定奠定基礎。[方法]采用3種方法制備甘薯黑斑病菌甘薯長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）孢子懸浮液，研究甘薯黑斑病菌快速大量產孢方法。[結果]洗滌PDA和洗滌薯片培養5～ 6 d后鏡檢孢子懸浮液，一個視野內孢子數分別約為93、95個。利用PS培養液培養1、2、4 d后鏡檢孢子數分別為 211、136、137個。[結論]采用PS液體培養基在特定培養條件下搖培1 d即可獲得大量高濃度孢子懸浮液，極大地縮短了黑斑病菌產孢時間，顯著提高了產孢量，且不易污染。

關鍵詞 甘薯黑斑病;孢子懸浮液;制備方法

中圖分類號 S435.311文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0127-03

甘薯（Ipomoea batatas Lam.）在我國每年的種植面積約500萬hm 占世界甘薯種植面積的50%左右[1]。甘薯黑斑病（sweeppotato black rot）是甘薯栽培和貯藏中的主要病害之一，在世界各甘薯產區均有發生，其病原菌為甘薯長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted），該菌分布廣泛、種群分化復雜，主要為害幼苗莖基部及塊根組織，引起死苗、爛床、爛窖，對甘薯生產影響極大[2]。帶有黑斑病菌的病薯中含有甘薯黑疤霉酮等物質，家畜食用后可引起中毒癥狀[3];用病薯做發酵原料會延緩發酵過程，降低乙醇產量和質量，嚴重制約甘薯產業的發展。目前，甘薯黑斑病的防治主要是以選育抗病品種及化學殺菌劑防治為主[4-5]。而甘薯抗病育種及藥劑篩選都需要大量的孢子懸浮液進行試驗。目前主要采用薯片法和黑斑病菌平板洗滌孢子法制備孢子懸浮液，但這2種方法耗時較長。同時，薯片法制備的孢子懸浮液由于無法保證全程無菌操作，不可避免地會被雜菌污染[6];而采用傳統的從黑斑病平板中洗滌孢子過濾的方法耗時長效率低，無法快速大量地為藥劑篩選和抗藥性風險評估等提供試驗所需的分生孢子懸浮液。因此，建立一種甘薯黑斑病菌快速大量產孢的技術體系是甘薯黑斑病精準抗病鑒定、甘薯黑斑病藥劑生物測定以及抗藥性風險評估等研究的重要條件之一。筆者研究甘薯黑斑病菌快速大量產孢方法，旨在建立一種新型的甘薯黑斑病菌快速大量產孢的技術體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑斑病菌的分離和純化：從甘薯窖中采集黑斑病發病薯塊，采用組織分離法分離甘薯黑斑病菌。首先清洗薯塊表面，然后用自來水流水沖洗約20 min，將帶病薯塊取出擦干置于超凈工作臺中，取黑斑病病健交接部位置于75%乙醇中進行表面消毒，再用0.1 %的升汞消毒后，用滅菌水清洗干凈后置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板中培養，經分離純化以及柯赫氏法則驗證確定后保留菌株。該菌株分離并保存于4 ℃冰箱中。

黑斑病菌培養：打取PDA平板中的菌碟，每個三角瓶中接種10 ～ 12個菌碟，將接種好的三角瓶置于30 ℃恒溫搖床中120 r/min搖培24 h。

孢子懸浮液制備：將搖培獲得的懸浮液用紗布過濾去除菌絲后，鏡檢測定孢子液濃度，并采用無菌水將孢子懸浮液濃度調節至試驗所需即可。

PS培養液的制備：馬鈴薯20 g加入1 L超純水煮沸至馬鈴薯完全爛軟，紗布過濾后加入15 g蔗糖，加超純水定容至1 L，每個三角瓶分裝30 mL，然后置于121 ℃高壓滅菌15 min備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘薯黑斑病菌最佳產孢方法篩選。采用PDA平板接種活化后的黑斑病菌菌碟，將接種好的平板置于25 ℃恒溫培養箱中培養5～ 6 d，采用30 mL無菌水洗滌平板表面孢子，紗布過濾去除菌絲后，測量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個視野內孢子數，設置3個重復，每個重復制片3張。該方法設為對照組①。

選擇大小適中、無病蟲害侵染的薯塊洗凈自然晾干后，采用75 %乙醇表面消毒后晾干，切成厚約1 cm的薯片，把切好的薯片放入配好的孢子懸浮液內浸一下，取出薯片晾干表面水分，再放入無菌培養皿內培養，期間采用紙巾或棉花團保濕紙，將接種的薯塊置于25 ℃恒溫培養箱中培養5～6 d，薯片表面長滿淺灰色的分生孢子，用30 mL無菌水沖洗，紗布過濾去除菌絲后，測量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個視野內孢子數，設置3個重復，每個重復制片3張。該方法設為對照組②。

采用馬鈴薯20 g加入1 L超純水煮沸至馬鈴薯完全爛軟，紗布過濾后加入15 g蔗糖，用超純水將培養液補足至1 L，每個三角瓶分裝30 mL，然后121 ℃高壓滅菌15 min備用。打取PDA平板中的菌碟，每個三角瓶中接種10～12個菌碟，將接種好的三角瓶置于30 ℃恒溫搖床中120 r/min搖培，1 d后取出，測量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個視野的孢子數。該方法為PS液體培養法。

1.2.2 不同培養時間PS液體培養法產孢量測定。采用上述PS液體培養法，培養甘薯黑斑病菌。每1、2、3、4 d取出3瓶培養液，每瓶培養液制片3張，測量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個視野的孢子數，不同培養條件下的產孢數。以上述對照組①和對照組②方法培養5～6 d作為處理對照。

2 結果與分析

2.1 最佳產孢方法篩選

由圖1可知，培養5～ 6 d后孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個視野內孢子數約為93個。由圖2可知，培養5～ 6 d后鏡檢孢子數約為95個，且該方法存在雜菌污染的可能性。PS液體培養法見圖3。由圖3可知，培養1 d后鏡檢孢子數為211個。

2.2 不同培養時間PS液體培養法產孢量

由圖4可知，使用PS液體培養基在特定培養條件下搖培1 d，在放大200倍顯微鏡下每個視野均可觀察到211個孢子，與采用對照①和對照②培養5～6 d制備的孢子懸浮液制備方法下平均每個視野可觀察到的孢子數93和95差異極顯著;同時，對比采用PS液體培養基搖培0、1、2和4 d所制備的孢子懸浮液，發現搖培2和4 d后獲得的孢子懸浮液在同樣放大倍數的顯微鏡下平均每個視野觀察到的孢子數分別為136和137，方差分析結果表明，PS液體培養基搖培2和4 d比搖培1 d所得到的孢子懸浮液中平均每個視野的孢子數211顯著降低，從圖5可以看出，培養4 d黑斑病菌孢子已有部分開始消解。

3 結論與討論

甘薯黑斑病菌侵染薯塊后會形成黑色凹陷病斑，并在病斑及周圍產生有毒物質，是造成甘薯爛窖的主要原因之一[7-8]。因此，建立甘薯黑斑病菌快速大量產孢的技術體系是甘薯黑斑病精準抗病鑒定、甘薯黑斑病藥劑生物測定以及抗藥性風險評估等研究的基礎之一。該研究通過對比3種甘薯黑斑病產孢方法，建立一種新型的甘薯黑斑病產孢體系。該試驗采用的PS液體培養基在特定培養條件下搖培1 d即可獲得大量高濃度孢子懸浮液，極大地縮短了黑斑病菌產孢時間，顯著提高了產孢量;同時由于培養期間全程無菌操作條件簡易可控，因此病原菌不易被污染，可以有效避免薯片法產孢培養的薯片腐爛、雜菌多、時間長等引起孢子液不純，使甘薯黑斑病抗性鑒定和甘薯黑斑病藥劑生物測定試驗更為精準高效。

參考文獻

[1]馬代夫，李洪民，唐君，等.中國甘薯產業的發展現狀與發展趨勢[C]//馬代夫.甘薯與糧食能源安全——中國徐州第四屆國際甘薯學術討論會暨第四屆中日韓甘薯學術討論會論文集.北京：中國農業大學出版社，2010：3-10.

[2]HALSTED B D.Some fungous diseases of the sweet potato：The black rot [J].New Jersey agriculture experiment station bulletin， 1890，76：7-14.

[3]孫厚俊，劉美艷，宗瑋瑋，等.黑斑病對甘薯體內幾種保護酶活性的影響[J].廣西農學報，201 26（3）：14-16.

[4]謝一芝，邱瑞鐮，戴起偉，等.甘薯抗黑斑病育種研究進展[J].雜糧作物，1997（2）：22-24.

[5]謝一芝，尹晴紅，戴起偉，等.甘薯品種抗黑斑病鑒定及其遺傳趨勢[J].植物遺傳資源學報，2003，4（4）：311-313.

[6]張德勝，張永超，喬奇，等.10種殺菌劑對甘薯黑斑病的毒力及聯合毒力[J].農藥，201 51（6）：452-454.

[7]賈趙東，郭小丁，尹晴紅，等.甘薯黑斑病的研究現狀與展望[J].江蘇農業科學，2011（1）：144-147.

[8]王碩.甘薯ACE抑制肽的制備及其降血壓活性研究[D].北京：中國農業科學院，2011.