46份粳稻品種抗稻瘟病基因的分子檢測及抗性評價研究

陳培峰 喬中英 謝裕林 董明輝 伍應保 朱勇良 宋云生

摘要 [目的]對46份粳稻品種抗稻瘟病基因進行分子檢測，并對其進行抗性評價。[方法]利用水稻稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21的功能標記對 46份育種材料進行分子標記檢測，結合稻瘟病抗性接種鑒定，對基因型與表型進行相關性分析。[結果]46 個品種中攜帶Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21抗性基因的材料分別為 18、35、22和16個，其中3個材料含有4個抗性基因;6個材料含有 3個抗性基因;25個材料含有 2個抗性基因;11個材料含有 1個抗性基因;1個未檢測到抗性基因。結合稻瘟病田間抗性鑒定表明，同時含有3個以上抗性基因的材料只有2份表現為中感（MS）和感病（S），其他均為中抗（MR）以上。[結論]單一抗病基因型的抗病能力因新生理小種的出現而不穩定，抗病基因的聚合利用和新的廣譜抗性基因的發掘迫在眉睫。

關鍵詞 水稻;抗稻瘟病基因;分子標記檢測;抗性評價

中圖分類號 S511文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0065-03

稻瘟病是水稻重要病害之一，具有傳播速度快、發生范圍廣、暴發頻率高、危害嚴重等特點，在我國常年均有不同程度的發生，造成的產量損失可達40%～50%，局部田塊甚至顆粒無收[1]。挖掘有效的抗病基因，通過生物技術將抗病基因導入水稻品種內快速培育出抗病水稻品種是解決水稻稻瘟病危害的重要途徑[2-5]。隨著分子標記技術的普遍應用，大量新的抗稻瘟病基因被定位在不同的染色體上。到目前為止，有50多個抗瘟基因（或QTLs）被定位。除了第3號染色體沒有發現抗稻瘟病基因外，其他染色體上都含有1～3個抗性基因位點。許多抗稻瘟病基因被定位在第6、11和12號染色體上[6-8]，抗性基因分子標記的設計研發為抗性基因在水稻抗病育種中的開發利用提供了有效手段。但稻瘟病菌容易發生變異，同一水稻產區稻瘟菌的種群結構及生理小種經常發生變化，導致抗病品種在種植數年后，抗性水平下降甚至喪失[9-10]。通過發掘、鑒定抗稻瘟病基因資源，鑒定抗病基因，對于有效、合理地利用抗病基因資源，利用分子標記輔助選擇培育持久抗稻瘟病品種有重要意義。筆者以江蘇省主要利用的4個抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21的分子標記對46份育種材料進行基因檢測，并對材料進行穗頸瘟人工接種鑒定，通過材料的抗病表現綜合評價抗病基因在育種中的利用價值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種 46 份，為蘇州市農業科學院水稻育種的中間穩定材料。

1.2 稻瘟病抗性田間鑒定方法

采用田間誘發的方式，用蘇御糯作為感病對照品種。5月12日育秧，地寬100 cm，插秧前劃行、插牌。每個品種南北方向，5行10穴插秧。在參試品種兩側插種感病誘發品種蘇御糯，間隔插秧。在水稻分蘗初期，田間撒播上年收集的稻瘟病菌標樣，有利于發病，在水稻基本黃熟后調查水稻穗頸瘟。按國家統一標準，檢查發病情況，分級記載。

1.3 稻瘟病抗性基因的分子標記

利用Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21抗性基因引物檢測材料，引物名稱、序列及其擴增片段預期大小見表 1。

1.4 稻瘟病抗性基因檢測

采用 SDS 法提取水稻基因組 DNA。以基因組DNA 為模板進行基因片段擴增，PCR 反應體系參照范方軍等[11]的方法。反應產物經 1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，在紫外凝膠成像儀上觀察并照相。

2 結果與分析

2.1 稻瘟病田間抗性鑒定結果

由表2可知，在46 份品種中，蘇2473表現為抗病（R）;蘇4081、蘇4088、蘇5069、蘇5234等 11個材料表現為中抗（MR）;蘇2479、蘇2483、蘇5073、蘇5079等21個材料表現為中感（MS）;蘇2766、蘇5126、蘇5127、蘇5283、蘇5286等 13 個品種表現為感病（S）;未有材料表現為高感（HS）。

2.2 稻瘟病抗性基因檢測結果

利用水稻稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21的功能標記檢測46份育種材料，結果表明（表2），蘇2473、蘇5069、蘇5073、蘇5079等18個材料含有抗稻瘟病基因 Pi-ta，占比為39.13%;蘇2473、蘇2479、蘇2483、蘇2766等35個材料含有抗稻瘟病基因 Pi-b，占比為76.09%;蘇2473、蘇2479、蘇2483、蘇4081 等22 個材料含有抗稻瘟病基因 Pi54，占比為47.83%;蘇2473、蘇5114、蘇5234、蘇5245等 16 個材料含有抗稻瘟病基因 Pi2 占比為34.78%。蘇2473、蘇6000、蘇6002 這3個材料含有4個抗性基因，蘇5069、蘇5114、蘇5234、蘇5878等 6 個材料含有 3 個抗性基因;蘇2479、蘇2483、蘇2766、蘇4081等 25個材料含有 2 個抗性基因;蘇5126、蘇5127、蘇5281、蘇5348等11個材料含有 1 個抗性基因;蘇5290未檢測到抗性基因。

結果還表明（表3），未檢測到抗性基因的1個材料表現為感病（S）;檢測到1個抗性基因的材料中有7個材料表現為中感（MS），4個材料表現為感病（S）;檢測到2個抗性基因的材料中有5個材料表現為中抗（MR），13個材料表現為中感（MS），7個材料表現為感病（S）;檢測到3個抗性基因的材料中有4個材料表現為中抗（MR），1個材料表現為中感（MS），1個材料表現為感病（S）;檢測到4個抗性基因有1個材料表現為抗病（R），2個材料表現為中抗（MR）。

3 結論與討論

培育和利用抗病品種是目前防治稻瘟病最經濟有效的措施，然而由于稻瘟病菌的致病性分化嚴重，生理小種多，變異頻繁，給抗病品種的選育帶來了困難，因此發掘、鑒定和利用抗病資源，并通過分子標記定位抗病基因，并通過標記輔助選擇提高抗病品種的選擇效率，對指導培育更優良的抗稻瘟病新品種具有重要的理論和實踐意義。Pi-ta 、Pi-b、Pi54和 Pi21是水稻育種中重要的抗稻瘟病基因，研究表明抗稻瘟病基因Pi-ta 和Pi-b與穗頸瘟抗性存在顯著相關性[11-12]。有研究發現Pi-ta、Pi-b、Pi54、Pikm在山東及黃淮區新選育品種中分布頻率較高，其中 Pi-b、Pi54、Pikm的分布頻率超過或接近50%，且Pikm與稻瘟病抗性存在顯著相關[13]。該研究表明，Pi-b在供試材料中分布頻率較高，達76.09%，大多數材料均含有Pi-b基因，Pi-ta和Pi21的分布頻率僅有35%左右。結合稻瘟病田間抗性鑒定表明，同時含有3個以上抗性基因的材料只有2份表現為中感（MS）和感病（S），其他均為中抗（MR）以上，而只含其中1個抗性基因材料中未出現中抗以上的材料。由于抗病品種的單一化以及稻瘟病菌的復雜性和易變性，單一優勢抗性基因的利用極易使得稻瘟病菌群體中的毒性小種演變成為優勢小種而造成水稻稻瘟病抗性喪失，因此，抗病基因的聚合利用和新的廣譜抗性基因的發掘是今后水稻抗稻瘟病育種工作的重點。

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