聚己內酯肝素涂層的制備與結構分析

唐家欽 周賢軒

摘要 [目的]分析聚己內酯肝素涂層的制備與結構。[方法]采用終點固定法在PCL表面制備肝素涂層，以共價鍵的形式把肝素分子還原端醛基連接到氨基修飾聚己內酯表面，充分暴露肝素分子的活性基團。[結果]制備的聚己內酯肝素涂層密度為4.8 μg/cm2，與已報道的肝素涂層相比較，肝素密度提高了1.3～2.4倍。傅里葉紅外光譜檢測表明，該材料增加了N-H振動峰和C-N振動峰。進一步用X射線光電子能譜分析（XPS）發(fā)現(xiàn)在具備肝素涂層的PCL表面增加了N、S、Na等元素信號。[結論]肝素還原端已經通過碳氮鍵與聚己內酯形成了共價結合，并且肝素涂層含量顯著提高，這將有利于對該材料功能的進一步研究。

關鍵詞 聚己內酯；肝素涂層；制備；結構

中圖分類號 Q939.9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0175-03

Abstract [Objective]The research aimed to analyze the preparation and structure of heparin coating on polycaprolactone.[Method]A heparin coating was prepared on the surface of the PCL using an endpoint fixation method， and the heparin molecule reducing aldehyde group was attached to the aminomodified polycaprolactone surface in a covalent bond form to fully expose the active group of the heparin molecule.[Result]The prepared polycaprolactone heparin coating had a density of 4.8 μg/cm2， and the heparin density increased by 1.3-2.4 times compared with the heparin coating reported.Fourier infrared spectroscopy showed that the material increased the NH vibration peak and the CN vibration peak.Further Xray photoelectron spectroscopy （XPS） analysis revealed that N， S， Na and other elements were added to the surface of PCL coated with heparin.[Conclusion]The heparin reducing end has formed a covalent bond with polycaprolactone through a carbonnitrogen bond， and the heparin coating content is significantly increased， which will facilitate the further study of the function of the material.

Key words Polycaprolactone；Heparin coating；Preparation；Structure

聚己內酯（polycaprolactone，PCL）是一種半結晶型脂肪族聚酯材料，因其無毒性、可生物降解性和良好的滲藥性，在農牧業(yè)重要經濟動物的醫(yī)療中有潛在的應用前景[1-3]。 這些生物可降解材料適于做植入性骨折固定材料、外科手術縫合線等，可避免二次手術造成的不必要的損傷。PCL是通過ε-己內酯單體在金屬陰離子絡合催化劑催化下開環(huán)聚合而成的高分子有機聚合物，結構如圖1a所示[4]。

通常認為在PCL等非生物材料表面制備肝素化涂層有利于阻止血細胞在材料表面聚積形成血液凝塊，增強材料的生物相容性。肝素是一種臨床廣泛使用的抗凝血藥物，它由動物細胞合成并分布于各種細胞表面，可以募集多種細胞因子，具有多種生物學功能如抗凝血、抗炎、抑制平滑肌細胞增殖、促進細胞黏附等[5]。肝素結構如圖1b所示，由艾杜糖醛酸和葡萄糖胺以1-4糖苷鍵連接的重復二糖單元組成，一般含有10～30個二糖單元，平均分子量為14 000 u。

目前的方法制備的肝素涂層存在易脫落及肝素含量偏低等缺陷。醫(yī)用非生物材料表面的肝素涂層制備有3個主要考量因素：肝素分子的穩(wěn)定性、肝素在生物材料表面的固定效率以及固定化肝素在生物材料表面能否保持足夠的生物學活性。據報道，肝素涂層制備方法有物理固定法、離子結合法、共價結合法等[6-7]。其中通過物理固定法和離子結合法制備的肝素涂層主要通過離子鍵及其他次級鍵與非生物材料相結合，易受到不同酸堿度及鹽離子濃度等環(huán)境條件影響，涂層不穩(wěn)定，難以保持肝素分子的生物學活性。已報道的共價結合法中，通常讓肝素分子多個活性基團與材料偶聯(lián)，使得其生物學活性損失較多，而且涂層的肝素分子密度也不夠大[8]。筆者采用終點固定法在PCL表面制備肝素涂層，有利于對該材料功能的進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

聚己內酯、肝素鈉、硫酸、氫氧化鈉購于國藥集團化學試劑有限公司；透析袋（10 kDa MWCO）、苯甲基磺酰氟、咪唑、Bradford法蛋白濃度測定試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；亞硝酸鈉、乙二胺、甲醇、氰基硼氫化鈉、甲苯胺藍購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；大腸桿菌表達菌株BL21/pHEPⅡ、BL21/pHEPⅢ由合肥工業(yè)大學微生物與酶工程實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1

肝素水解酶HEP Ⅱ與HEP Ⅲ的表達與純化。

分別挑取肝素水解酶表達菌株BL21/pHEP Ⅱ、BL21/pHEP Ⅲ單克隆37 ℃過夜活化。菌液按1%（體積比）分別接種至1 L LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h至OD600值為0.6左右。加入誘導劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.2 mmol/L，22 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。

過夜培養(yǎng)的菌液5 000 g離心20 min，收集菌體。用30 mL Solution I（Tris-HCl 20 mmol/L、pH 7.6、NaCl 200 mmol/L）重懸菌體，加入苯甲基磺酰氟（PMSF），用超聲波破碎細胞（工作時間5 s，暫停時間5 s，功率50%，總時間30 min）。將細胞破碎液12 000 r/min 4 ℃ 離心20 min，收集上清。用Solution Ⅰ 充分平衡Ni親和層析柱，粗蛋白溶液上樣后，用Solution II（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，200 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑）洗脫雜蛋白，用Solution Ⅲ（20 mmol/L Tris-HCl、pH 7.6、200 mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑）洗脫目的蛋白。10 kDa的透析袋充分透析后用Bradford法蛋白濃度測定試劑盒對蛋白質濃度進行定量。

1.2.2 聚己內酯肝素涂層的制備。

為了把肝素分子固定在聚己內酯材料表面，首先需要活化肝素并制備氨基化聚己內酯（PCL-NH2），使肝素分子末端生成的醛基與聚己內酯表面的氨基通過脫水反應，形成共價鍵而偶聯(lián)在一起。在100 mL 3.9 mol/L的亞硝酸溶液（pH 4.0）中加入25 mL 25 mg/mL肝素溶液，室溫下反應20 min。用1 mol/L NaOH調節(jié)pH至8.0后在去離子水中充分透析。然后將醛基化肝素樣品冷凍干燥， PBS溶解定容至20 mg/mL保存?zhèn)溆谩?/p>

將PCL材料置于1 mol/L NaOH中50 ℃水浴24 h，用去離子水漂洗，室溫干燥后放入培養(yǎng)皿中，加入10 mL 40%乙二胺，室溫浸泡2 h。吸去乙二胺，用PBS洗滌，室溫干燥過夜，即得到PCL-NH2。把PCL-NH2放入20 mg/mL醛基化肝素與100 mmol/L NaBH3CN等體積混合液中，室溫靜置2 h。吸去培養(yǎng)皿中液體，用PBS充分洗滌并室溫干燥，即得到肝素涂層修飾的聚己內酯材料（PCL-HEP）。

1.2.3 PCL-HEP肝素含量測定。

Smith等[9]提出了甲苯胺藍法測定肝素含量的方法。該研究在Smith等方法的基礎上加以改進，染色后的PCL-HEP經PBS洗滌后用肝素酶裂解，測量裂解液中的甲苯胺藍含量。改進后的方法去除材料表面結合不牢固的甲苯胺藍，結果更加準確、直觀。

首先繪制一組標準曲線，取6支試管，分別加入40、50、60、70、80、90 μL的0.0166%肝素溶液，補加0.2%NaCl至100 μL，再加入100 μL 0.005%甲苯胺藍溶液。旋渦振蕩30 s，每管加入1 mL正己烷，劇烈振蕩30 s，1 000 r/min離心3 min。棄去有機相，用分光光度計測水相OD630。以肝素含量為橫坐標、OD630值為縱坐標，繪制標準曲線，根據標準曲線計算出每OD對應的肝素含量。取一粒PCL-HEP放入一個干凈的1.5 mL離心管中，加入100 μL 0.2% NaCl溶液和100 μL 0.005%甲苯胺藍溶液，混勻，室溫靜置，染色過夜。PCL作對照，每組做3個平行。吸去染色液，加入1 mL PBS漂洗，重復洗滌3遍。加入200 μL 0.05 mg/mL HEP Ⅱ、0.05 mg/mL HEP Ⅲ混合溶液，37 ℃反應4 h，測酶解液的OD630，根據甲苯胺藍標準曲線計算得出固定化肝素的含量。

1.2.4 XPS分析。

X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy， XPS）技術作為研究物體表面組成和結構的常用能譜分析技術，具有無破壞性、表面靈敏等特點，被廣泛應用于表面分析。為了驗證肝素成功地固定在聚己內酯表面，檢測PCL-HEP和PCL的表面元素組成，對樣品做X射線光電子能譜掃描。將PCL-HEP樣品（或PCL樣品）放入一個干凈的1.5 mL 離心管中，使用X射線光電子能譜儀檢測，所用陽極靶為Al靶，功率300 W。首先測試樣品的0～1 400 eV 的全掃描譜得到總譜圖，獲得表面元素種類的信息，而后對樣品的N1s和S2p軌道進行窄譜掃描，數(shù)據用Thermo Avantage軟件處理。

1.2.5 傅里葉紅外光譜檢測。

傅里葉紅外光譜（FTIR）能夠從分子水平反映物質的化學結構，被廣泛應用于材料、生物、化工等領域。為了檢測肝素化修飾前后聚己內酯結構的變化，確認肝素成功地固定在聚己內酯表面，將PCL-HEP樣品（或PCL樣品）放入一個干凈的1.5 mL 離心管中，使用Nicolet 67傅里葉紅外光譜儀檢測，掃描波數(shù)范圍為500～4 000 cm-1，數(shù)據用Omnic 8.2軟件處理。

2 結果與分析

2.1 聚己內酯肝素涂層的制備與定量

為了把肝素固定在聚己內酯表面，首先在PCL表面引入氨基，同時制備醛基化肝素，然后利用氨基和醛基之間的席夫堿反應，以共價鍵的形式把肝素分子還原端醛基連接到氨基修飾的PCL表面，從而得到具有肝素涂層的PCL材料。PCL-HEP的肝素涂層可用甲苯胺藍溶液染色檢測，結果如圖2所示。

根據甲苯胺藍染色分析結果顯示，聚己內酯材料PCL-HEP的肝素涂層密度為4.8 μg/cm2，與對照組差異顯著。PCL-HEP的肝素涂層可與甲苯胺藍結合而顯色，而對照組PCL不能被甲苯胺藍染色。據報道，在聚氨酯表面制備的肝素涂層密度為1.4～3.6 μg/cm2 [8]，該研究中聚己內酯肝素涂層密度與之相比提高了1.3～2.4倍， 可能是因為用于偶聯(lián)的活性基團較小，空間位阻效應較小，使得更多的肝素分子可以通過共價鍵與聚己內酯材料相連接。

2.2 PCL-HEP的傅里葉紅外光譜分析

PCL-HEP肝素涂層的結構使用傅里葉紅外光譜儀進行了分析，掃描范圍為500～4 000 cm-1。從PCL和PCL-HEP的紅外掃描波形（圖2）可看出，相對于PCL，PCL-HEP在3 300～3 480 cm-1處顯示了N-H和C-N的振動峰，在1 570 cm-1處顯示了N-H特征峰。PCL分子中沒有N-H鍵和C-N鍵，而PCL-HEP肝素涂層通過乙二胺偶聯(lián)到了PCL上，含有豐富的N-H和C-N鍵。

2.3 PCL-HEP肝素涂層的XPS分析

為了進一步檢測PCL-HEP肝素涂層的元素組成，對PCL-HEP和PCL進行XPS全掃描，用Thermo Avantage軟件處理分析結果。PCL-HEP的掃描分析結果如圖3a所示，PCL的掃描分析結果如圖3b所示。在PCL-HEP 的XPS全譜掃描譜圖上，出現(xiàn)了Na1s、O1s、N1s、C1s等元素信號，而PCL只出現(xiàn)了O1s、C1s等元素信號。PCL只含有O元素和C元素， N元素是乙二胺分子和肝素分子的組成元素，Na元素是肝素鈉的組成元素。S元素是肝素分子的特征元素，但在PCL-HEP的XPS全譜掃描譜圖上，S2p信號不明顯，可能與肝素總量較少有關。

為了進一步分析PCL-HEP樣品表面元素組成，對N元素和S元素進行了窄波掃描。N元素窄波掃描結果用Thermo Avantage軟件進行擬合，其分析如圖4所示。PCL-HEP和PCL的N元素掃描結果與預期一致，PCL本身不含有N元素，N元素窄波掃描沒有信號峰；而PCL-HEP樣品中乙二胺分子和肝素分子都含有N元素，N元素窄波掃描出現(xiàn)了N元素的強信號峰。同樣地，S元素窄波掃描結果用Thermo Avantage軟件處理，對信號峰進行擬合，結果如圖5所示。S元素窄波掃描結果顯示了PCL-HEP的S2p信號，而PCL分析結果沒有顯示S元素信號。這些分析結果清楚表明PCL-HEP表面存在共價偶聯(lián)的肝素涂層。

3 結論

在該研究中，聚己內酯材料經過乙二胺處理在表面引入了活性氨基層，同時用亞硝酸部分降解的方法制備了醛基化肝素。利用醛基化肝素與氨基發(fā)生席夫堿反應，以共價鍵的形式把肝素分子還原端醛基連接到氨基修飾聚己內酯表面，充分暴露了肝素分子的活性基團，并且穩(wěn)定的共價鍵連接使肝素涂層的穩(wěn)定性及含量都得到了顯著提高。PCL-HEP中肝素含量為4.8 μg/cm2，與已報道的肝素涂層相比較[8]，肝素密度提高了1.3～2.4倍。 PCL-HEP肝素涂層進一步通過X射線光電子能譜技術和傅里葉紅外光譜技術進行了分析，顯示了PCL-HEP增加了N、S和Na元素，以及增加了C-N鍵和N-H鍵。

該研究還改進了甲苯胺藍染色法。用大腸桿菌表達2種肝素水解酶HEP Ⅱ 和HEPⅢ，利用純化的肝素水解酶把結合于肝素分子的甲苯胺藍分子釋放出來，用于對PCL-HEP樣品中肝素含量的測定。改進后的甲苯胺藍染色測定肝素多糖方法更加直接、準確。

參考文獻

[1] KOSOBRODOVA E，KONDYURIN A，CHRZANOWSKI W，et al.Effect of plasma immersion ion implantation on polycaprolactone with various molecular weights and crystallinity [J].Journal of materials science materials in medicine，2018，29（1）：1-18.

[2] KEVADIYA B D，THUMBAR R P，RAJPUT M M，et al.Montmorillonite/poly（εcaprolactone）composites as versatile layered material：Reservoirs for anticancer drug and controlled release property[J].European journal of pharmaceutical sciences，2012，47（1）：265-272.

[3] SINGH S，WU B M，DUNN J C Y.The enhancement of VEGFmediated angiogenesis by polycaprolactone scaffolds with surface crosslinked heparin [J].Biomaterials，2011，32（8）：2059-2069.

[4] ALAMIMILANI M，ZAKERIMILANI P，VALIZADEH H，et al.Preparation and evaluation of PCLPEGPCL micelles as potential nanocarriers for ocular delivery of dexamethasone [J].Iranian journal of basic medical sciences，2018，21（2）：153-164.

[5] YAN H H，BAO F F，ZHAO L P，et al.Cyclic AMP（cAMP）receptor proteincAMP complex regulates heparosan production in Escherichia coli strain Nissle 1917[J].Applied and environmental microbiology，2015，81（22）：7687-7696.

[6] GORE S，ANDERSSON J，BIRAN R，et al.Heparin surfaces：Impact of immobilization chemistry on hemocompatibility and protein adsorption [J].Journal of biomedical materials research Part B：Applied biomaterials，2014，102（8）：1817-1824.

[7] IRVINE S A，STEELE T W，BHUTHALINGAM R，et al.Quantification of aldehyde terminated heparin by SECMALLSUV for the surface functionalization of polycaprolactone biomaterials[J].Colloids and surfaces B：Biointerfaces，2015，132：253-263.

[8] MURUGESAN S，XIE J，LINHARDT R J.Immobilization of heparin：Approaches and applications[J].Curr Top Med Chem，2008，8（2）：80-100.

[9] SMITH P K，MALLIA A K，HERMANSON G T.Colorimetric method for the assay of heparin content in immobilized heparin preparations[J].Analytical biochemistry，1980，109（1）：466-473.