擬南芥SSP1基因GFP載體構(gòu)建及GFP植株篩選

吳席 樊婷婷 方雪

摘要 [目的]以野生型擬南芥為材料構(gòu)建SSP1基因GFP載體及GFP轉(zhuǎn)基因植株。[方法]通過(guò)提取野生型擬南芥的RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，并以cDNA為模板，利用高保真酶，進(jìn)行SSP1基因的克隆，將克隆所獲得SSP1基因和pXB94-GFP質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，利用T4-DNA ligase進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)菌落PCR和測(cè)序獲得陽(yáng)性單克隆。通過(guò)質(zhì)粒抽提試劑盒提出構(gòu)建好的重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，通過(guò)菌落PCR鑒定出陽(yáng)性單菌落。將獲得的陽(yáng)性菌通過(guò)花序浸染法轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，并通過(guò)抗性篩選獲得陽(yáng)性植株。[結(jié)果]克隆SSP1基因成功，菌落PCR顯示SSP1基因成功連接到pXB94-GFP質(zhì)粒上并成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，抗性篩選獲得了SSP1-GFP轉(zhuǎn)基因植株。 [結(jié)論]成功獲得SSP1-GFP轉(zhuǎn)基因植株，為接下來(lái)進(jìn)一步研究SSP1基因功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 擬南芥；SSP1；載體；GFP轉(zhuǎn)基因植株

中圖分類(lèi)號(hào) Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）21-0119-03

Abstract [Objective]To build up the vector of Arabidopsis SSP1GFP and transgenic lines. [Method]Reverse transcription to cDNA by extracting the RNA of wild type Arabidopsis. The CDS fragment of SSP1 gene was amplified by PCR. After treatment with restriction enzymes and T4DNA ligase， the gene was connected to plasmid. Transfer the connection product to DH5α and a positive clone was identified. Then， transfer the recombinant to GV3101. The floraldip method was used to transfer it into wild type Arabidopsis. Finally， we obtained positive plants through resistance screening.[Result]We succeeded in cloning SSP1 gene. The recombinant plasmid was obtained and we got the transgenic lines. [Conclusion]The successful acquisition of SSP1GFP transgenic lines laid the foundation for further research on the function of SSP1 gene.

Key words Arabidopsis；SSP1；Vector；GFP transgenic lines

土壤鹽堿化是世界范圍內(nèi)限制農(nóng)業(yè)發(fā)展和作物生產(chǎn)的重要因素之一，探索鹽脅迫的作用機(jī)理以及提高植物抗鹽性的途徑具有重要的理論和實(shí)際意義[1-3]。尋找提高植物抗鹽性的關(guān)鍵基因并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)植物品種進(jìn)行優(yōu)化改良是解決上述問(wèn)題的一種行之有效的方法 [4-7]。筆者通過(guò)鹽脅迫篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SSP1基因可以使擬南芥對(duì)鹽脅迫有所響應(yīng)。通過(guò)克隆SSP1基因，并通過(guò)基因工程手段構(gòu)建SSP1-GFP轉(zhuǎn)基因植株，以進(jìn)一步探究SSP1基因在擬南芥響應(yīng)鹽脅迫中所起到的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料。

植物材料為擬南芥（Arabidopsis thaliana），購(gòu)于美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心，均為哥倫比亞（Columbia，Col）遺傳背景，后由合肥工業(yè)大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室繁殖所得。

1.1.2 試劑。

TIANprep Mini Plasmid Kit Ⅱ（TIANGEN）、T4-DNA Ligase（NEB）、 PrimeScript RT-PCR Kit （TaKaRa）、限制性?xún)?nèi)切酶Xho I（NEB）、EcoR I（NEB）、TransStart FastPfu DNA Polymerase ETransGen、壯觀霉素、慶大霉素、卡那霉素。

1.1.3 宿主和載體。

大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌GV3101，載體pXB94-GFP。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥無(wú)菌苗培養(yǎng)。

配制MS固體培養(yǎng)基，從冰箱里取出MS培養(yǎng)基放置至室溫，稱(chēng)取所需要的組分放入三角瓶中，加入所需ddH2O，用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8，用封口膜封好，121 ℃、25 min高溫高壓蒸汽滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右，將培養(yǎng)基均勻倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后即可播種。將消毒后的擬南芥種子于濾紙上晾干，種子晾干以后按試驗(yàn)需要用牙簽蘸取點(diǎn)在培養(yǎng)皿上，待一個(gè)培養(yǎng)皿播種完成后，用封口膜將培養(yǎng)皿封好；將播種完成后的培養(yǎng)皿倒置于4 ℃冰箱中春化2～3 d，再放入溫室中豎直培養(yǎng)14 d。

1.2.2 擬南芥cDNA獲取。

提前將研缽清洗干凈，然后用錫紙包裹起來(lái)，置于180 ℃的烘箱中，高溫烘烤足夠時(shí)間；試驗(yàn)之前要提前將所用試劑如氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇等放入-20 ℃冰箱中預(yù)冷；稱(chēng)取所需材料100 mg左右，置于研缽中，加入適量液氮進(jìn)行充分研磨；向研磨破碎后的材料中加入Trizol裂解液1 mL，立即快速研磨直至全部融化；轉(zhuǎn)移研磨完成后的材料到1.5 mL離心管中，于超凈臺(tái)中靜置5 min，置于冷凍離心機(jī)中4 ℃離心5 min，轉(zhuǎn)速13 000 r/min，小心吸取上清至另一新的1.5 mL EP管中；向1.5 mL EP管中加入200 μL預(yù)冷后的氯仿，劇烈振蕩15 s，置于超凈臺(tái)靜置5 min；利用冷凍離心機(jī)4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，吸取上層水相中的上清液至新的1.5 mL離心管中（切勿吸取到中間層物質(zhì)，否則會(huì)造成DNA污染）；向EP管加入500 μL預(yù)冷后的異丙醇，輕輕顛倒混勻，于超凈臺(tái)靜置15 min；使用冷凍離心機(jī)4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，小心棄除上清，沉淀即為RNA；使用75%乙醇1 mL清洗沉淀；

冷凍離心機(jī)8 000 r/min，4 ℃離心5 min，盡可能棄去上清，于超凈臺(tái)室溫干燥10 min，使乙醇揮發(fā)干凈；向離心管中加入40 μL的RNase-ddH2O溶解，并放入65 ℃的水浴中10 min，使RNA沉淀充分溶解，溶解后吸出少量立即檢測(cè)其濃度與純度；檢測(cè)其濃度與純度后，根據(jù)結(jié)果將所得RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3 SSP1基因的克隆。

利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)以下引物進(jìn)行基因克隆，上游引物FP1：5′-CCGCTCGAGATGGCTGAGGTGGGAAAAG-3′，下游引物RP1：5′-CCGGAATTCTTAGCTTTGGGCAGGCTCTGT-3′，以獲得的cDNA為模板進(jìn)行基因克隆。

1.2.4 酶切、連接及菌落PCR鑒定。

將克隆獲得的SSP1基因和pXB94-GFP質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶Xho I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，并利用T4-DNA Ligase進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，并涂布于含有壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。菌落PCR鑒定引物為上游引物F2：5′-TTCGCAAGACCCTTCCTCTA-3′，下游引物RP2：5′-TTAGCTTTGGGCAGGCTCTGT-3′。

1.2.5 花序浸染法獲取轉(zhuǎn)基因擬南芥。

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101中，并通過(guò)菌落PCR鑒定陽(yáng)性單克隆，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，配制浸染液，進(jìn)行花序浸染，隔7 d，再次進(jìn)行浸染。將獲得的擬南芥種子置于含有卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選，獲取陽(yáng)性植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥SSP1基因的克隆

將野生型擬南芥的種子經(jīng)過(guò)消毒以后播種于MS培養(yǎng)基上，并于4 ℃春化 3 d，置于植物培養(yǎng)間培養(yǎng)14 d，用獲得的野生型擬南芥提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA。以稀釋5倍后的cDNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增SSP1基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，擬南芥網(wǎng)站顯示SSP1基因CDS全長(zhǎng)為1 392 bp，與電泳結(jié)果一致，說(shuō)明SSP1克隆成功。

2.2 目的片段和質(zhì)粒雙酶切

前期引物設(shè)計(jì)時(shí)，已經(jīng)在基因克隆上下游引物上分別添加了Xho I和EcoR I的酶切位點(diǎn)，所以使用限制性?xún)?nèi)切酶Xho I和EcoR I對(duì)通過(guò)基因克隆獲得的SSP1基因和pXB94-GFP質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切。酶切以后進(jìn)行電泳檢測(cè)獲得結(jié)果如圖2所示。

2.3 連接和大腸桿菌轉(zhuǎn)化后陽(yáng)性克隆鑒定

將獲得的雙酶切以后的SSP1基因和pXB94-GFP質(zhì)粒用T4-DNA Ligase酶進(jìn)行連接，16 ℃連接16 h，將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，待長(zhǎng)出單克隆以后，挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，菌落PCR鑒定結(jié)果如圖3所示。PCR條帶與目的條帶大小一致，說(shuō)明其為陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序以后，與SSP1CDS序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果完全一致，說(shuō)明SSP1-GFP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及花序浸染

將SSP1-GFP重組質(zhì)粒通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101，待其長(zhǎng)出單菌落以后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖4所示，獲得陽(yáng)性單克隆。將陽(yáng)性單克隆進(jìn)行擴(kuò)培，并通過(guò)花序浸染法，對(duì)開(kāi)花期的野生型擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。

2.5 SSP1-GFP轉(zhuǎn)基因植株的抗性篩選

獲取通過(guò)花序浸染法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因后的擬南芥種子，將獲得的種子消毒以后播種在含有卡那霉素抗性的MS平板上，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，長(zhǎng)出來(lái)的小苗（具有根，子葉顏色嫩綠）就是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，如圖5所示，將轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株移至土壤中置于溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，待植株果莢成熟以后，單株收取種子，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3 討論

鹽脅迫是自然界中主要的幾種非生物脅迫之一，其對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量有極大的影響，且對(duì)生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定造成威脅。迄今為止，全球范圍內(nèi)約有鹽堿化土地950萬(wàn)hm2，我國(guó)的鹽堿化土地面積約為270萬(wàn)hm2 [8]。一旦土壤中的可溶性鹽超標(biāo)，就會(huì)對(duì)生長(zhǎng)在其上的大部分植物造成傷害。鹽脅迫包括滲透脅迫和離子脅迫以及由此引起的次級(jí)脅迫如氧化脅迫等，這一系列的影響可能會(huì)造成植物生長(zhǎng)滯緩，甚至死亡[9-18]。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)植物品種進(jìn)行優(yōu)化改良是應(yīng)對(duì)植物鹽脅迫的一個(gè)重要方法[19-21]，因此應(yīng)致力于尋找提高植物抗鹽性的關(guān)鍵基因。前期結(jié)果顯示SSP1基因參與了植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，因此通過(guò)構(gòu)建SSP1-GFP轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)SSP1基因的功能進(jìn)行進(jìn)一步探究，以期進(jìn)一步解析SSP1基因在植物對(duì)鹽脅迫響應(yīng)中所起的作用。

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