一個耐鎘基因過表達載體構建及轉基因植株的篩選鑒定

嚴星星 歐陽劍 黃瑩

摘要 [目的]進一步研究MNB1基因在植物應對鎘脅迫響應中的功能，構建擬南芥中MNB1基因過量表達載體，通過篩選鑒定最終獲得相應的轉基因植株。[方法]以野生型擬南芥cDNA為模板，PCR擴增MNB1基因全長，將該基因連接到過量表達載體上；然后將構建成功的重組載體轉化至農桿菌菌株GV3101，浸花法轉化野生型植株；最后利用轉基因篩選與遺傳鑒定獲得MNB1轉基因陽性植株。[結果]MNB1基因CDS全長1 368 bp，酶切連接后轉化大腸桿菌鑒定得到陽性菌落，測序結果經比對完全正確。通過抗性篩選及PCR電泳檢測獲得陽性轉基因植株。[結論]MNB1基因過表達載體構建成功并獲得相應轉基因植株，為進一步研究該基因調控植物鎘脅迫響應中的功能及其分子機制奠定基礎。

關鍵詞 擬南芥；MNB1基因；過表達；轉基因植株

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0116-03

Abstract [Objective]In order to further study the function of MNB1 gene in response to cadmium stress in plants， the overexpression vector of MNB1 gene in Arabidopsis was constructed， and the corresponding transgenic plants were finally obtained through screening and identification.[Method] The fulllength MNB1 coding sequence was amplified through PCR from cDNA of Arabidopsis （Col0） using specific primers and cloned into the overexpression vector. Then the resulting construct was transformed into Agrobacterium strain GV3101 for transformation into the Col0 plants by the floral dip method. The transgenic lines were isolated through antibiotic screening and genetic identification.[Result]The fulllength CDS of MNB1 gene was 1 368 bp， which was identified by enzyme digestion and transformed into E. coli. The positive clones were identified and the sequencing results were completely correct. Positive transgenic plants were obtained by resistance screening and PCR electrophoresis.[Conclusion]The construction of MNB1 gene overexpression vector was successful and the corresponding transgenic plants were obtained， which laid the foundation for further study on the function and molecular mechanism of this gene regulating plant stress response to cadmium.

Key words Arabidopsis thaliana；MNB1 gene；Overexpression；Transgenic lines

隨著人口快速增長、工業發展、工廠及生活廢棄物的排放以及農業化肥、農用藥物等施用量的不斷增加，許多有害有毒物質不斷進入土壤中，造成土壤重金屬污染，已經成為世界性嚴峻的環境問題之一[1-2]。其中重金屬鎘是對動植物具有高度毒性的最危險的污染物之一，給生態環境和食品安全帶來了嚴重的威脅。鎘暴露可引起肺氣腫和骨質疏松癥，導致人體肺、腎和骨骼的不可逆損傷[3]。在過量的重金屬暴露下，植物也會表現出生物量減少、葉片萎黃、抑制根系生長和形態改變，常常導致植物過度暴露死亡[4]。所以植物對重金屬例如鎘的耐受性和積累能力在植物修復和糧食安全中的潛在應用激起了人們的興趣。植物對重金屬鎘脅迫的響應機制主要包括降低金屬生物利用度、控制金屬流入、金屬螯合、促進金屬外排和金屬誘導活性氧的解毒等途徑。植物通過大量的防御機制，包括復雜的天然免疫系統來保護自己免受各種各樣病原體，如細菌、真菌、病毒等的侵害[5]。植物可以區分自我與非我或檢測特定的病原體。通過信號介導的防御反應能導致植物細胞壁的固化，生產微生物代謝產物和病理相關蛋白等[6]。信號分子，例如ROS、乙烯、SA和茉莉酸在激活防御機制的復雜信號網絡中扮演著重要的角色[7]。

在前期研究的基礎上，發現MNB1功能缺失突變體表現出對重金屬鎘敏感的表型，因此找到MNB1這個基因作為研究目標。已有研究表明所有已知的植物凝集素可以分為12大凝集素家族[8]。植物體中的甘露糖結合凝集素，即MNB，在植物體受到病原體攻擊的防御信號傳導中起到關鍵性的作用。筆者擬通過構建MNB1基因過量表達載體，篩選并鑒定得到的轉基因陽性植株，以期為進一步研究該基因在植株應對鎘脅迫響應中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料。該試驗所用的植物材料是擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞（Columbia，Col）生態型，記作WT（wild-type，Col-0），購自美國擬南芥種子資源中心。載體構建所用質粒pART27，大腸桿菌DH5α，農桿菌GV3101。

1.1.2

主要試劑。Easy Taq DNA Polymerase（TransGen）；T4-DNA Ligase（TaKaRa）；PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa）；限制性內切酶Kpn I和Xho I（NEB）；Agar，NaCl，Yeast extract，Tryptone，Gold View，DNA Loading buffer，Marker，dNTPs，異丙醇，氯仿，無水乙醇，75%乙醇，葡萄糖，蔗糖，Silwet L-77，MES，VB5等。

1.2 方法

1.2.1

Trizol法提取植物總RNA。從培養皿或處理液中用大槍頭將擬南芥幼苗樣品挑出，用濾紙將水分吸干，將樣品放入預冷的研缽，加入適量液氮，待液氮快干時立即迅速研磨至樣品粉碎。

粉碎后均勻加入1 mL Trizol（存于4 ℃冰箱），盡量使粉末被完全覆蓋。每次研磨完一個樣品應立即置于冰上。研磨全部結束后室溫靜置5 min。在超凈工作臺中向每個樣品里快速加入200 μL氯仿，劇烈混勻15 s，可渦旋。室溫靜置3 min后，13 000 r/min、4 ℃離心15 min。離心結束后，取樣時保持離心角度不變，緩緩吸取上清液500 μL至新的EP管中，并做好標記。此時應輕緩地加入500 μL異丙醇，并立即輕輕顛倒混勻6～8次。

室溫靜置10 min后，13 000 r/min、4 ℃離心10 min。倒掉上清，留取沉淀（盡量倒干凈）。沿著管壁緩緩加入1 mL 75%乙醇（事先配好存于-20 ℃），勿吹打沉淀，8 000 r/min、4 ℃離心5 min。重復洗滌1次，倒掉上清，用黃槍頭將液體吸取干凈，盡量不要觸碰到沉淀。在超凈臺中晾干沉淀，使乙醇完全揮發，約8 min。加入30 μL DEPC水溶解沉淀，并置于60 ℃水浴鍋內促進溶解。吸取5 μL樣品檢測其純度和濃度。

1.2.2

大腸桿菌的轉化。從-80 ℃冰箱中取出感受態細胞，迅速放在冰上解凍融化10 min。取5～10 μL連接產物加入50 μL感受態細胞中（在冰盒中操作，不可吹打，輕輕快速混勻），冰浴30 min。之后42 ℃熱激90 s，快速將管取出放在冰上靜置5 min。每管加入800 μL無菌液體LB培養基。在搖床上振蕩培養，設置280 r/min、37 ℃、45 min。4 000 r/min、離心5 min，棄上清。剩300～500 μL重懸涂布LB固體培養基的平板上，正置30 min吹干，再于37 ℃，倒置恒溫培養過夜。取出培養過夜的平板，在超凈工作臺中挑取單一菌落至LB液體培養基，每個EP管約300 μL，用槍頭挑菌。250 r/min、28 ℃振蕩培養至培養基渾濁，5 h左右，進行菌落PCR鑒定。

1.2.3 浸花法浸染擬南芥。將-80 ℃保存的菌種在含50 mg/L Spec、50 mg/L Gen的固體培養基上接種培養，并劃線，挑取單菌落于500 μL的LB培養基（50 mg/L Spec，50 mg/L Gen）中，28 ℃、220 r/min培養過夜。菌液搖勻后進行PCR鑒定，取陽性菌液200 μL轉接到100 mL LB液體培養基（50 mg/L Spec，50 mg/L Gen）中，搖床培養至OD600 為1.2～1.6，于5 000 r/min離心10 min，棄上清，配制浸染緩沖液，重懸沉淀，再次離心，重復1次。加入適量緩沖液，將菌液稀釋至OD600為0.5～0.8，再按比例加入Silwet L-77。

用消毒剪去除已授粉的花、果莢，倒置于裝有滲透緩沖液的5 mL EP管中浸染20 s，使植株表面浸有一層水膜即可。將整盆野生型植株浸完后，貼上標簽做好標記，覆蓋保鮮膜以保持濕度，放在紙盒中避光培養，24 h后取下浸染后包上的薄膜，于室溫中繼續培養。

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增

為了驗證MNB1基因在擬南芥應對鎘脅迫調控中的功能，構建了35S：：MNB1過量表達載體。首先進行目的片段擴增，即克隆MNB1基因。以擬南芥幼苗為材料參照植物總RNA提取方法，提取植物的總RNA，提取時應盡量避免mRNA降解，總RNA中包括mRNA、tRNA和rRNA，利用其中mRNA反轉錄獲得植物的cDNA。再以cDNA為模板擴增所需目的基因，結果見圖1。由圖1可知，獲得的基因片段與預期大小一致，所需目的片段大小為1 368 bp。

2.2 過表達載體的連接與轉化

為構建MNB1的35S過表達載體，通過2種限制性內切酶Kpn I和Xho I分別酶切目的片段和pART27質粒載體，該試驗所用的pART27為改造過的質粒，質粒上加入Kpn I及Xho I酶切位點。酶切后進行電泳檢測，酶切后基因和載體條帶清晰、大小正確，方可用于下一步試驗。將酶切過的基因和載體用T4連接酶進行連接，并用熱激法導入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，培養過夜后如圖2所示。由圖2可知，初步通過抗性篩選獲得了重組質粒單菌落，有待下一步鑒定。

2.3 陽性重組質粒的PCR鑒定

為檢驗克隆的MNB1基因序列信息是否正確和MNB1是否連接到重組質粒上，用含相應抗生素（該試驗中使用壯觀霉素）的LB平板篩選陽性單克隆，菌落生長情況如圖2所示。再進行菌落PCR，任意挑取7個單菌落，在裝有800 μL LB（含100 μg/mL壯觀霉素）的1.5 mL離心管中37 ℃培養4 h左右。取1～2 μL上清液作模板進行PCR擴增，將PCR產物進行電泳檢測，結果見圖3。除了5號菌落，其他6個單菌落都是陽性重組質粒。將圖3中1號菌液送到測序公司測序。測序結果通過NCBI blast比對后顯示，克隆到的MNB1基因序列完全正確，說明過表達載體構建成功。

2.4 轉基因株系的抗性篩選與鑒定

將測序正確的質粒電擊轉化到GV3101農桿菌菌株，用含有50 μg/mL壯觀霉素和50 μg/mL慶大霉素的LB固體培養基，篩選鑒定陽性克隆，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，用轉化成功的農桿菌通過浸花法浸染野生型植株，收種。將收獲的種子干燥春化后撒到含有50 μg/mL卡那霉素的1/2 MS 平板上正常培養14 d，生長出正常的真葉與根，挑取生長嫩綠且有根的幼苗進行移栽，抗性篩選結果如圖4所示。

移栽的植株培養到21 d左右時，剪取MNB1轉基因植株葉片，提取基因組DNA。PCR鑒定MNB1轉基因陽性株系，PCR鑒定電泳結果如圖5。由圖5可知，抗性篩選得到的植株都是轉基因陽性植株，都成功地過量表達了MNB1基因，這表明過表達載體構建以及轉基因株系的篩選與鑒定都獲得了成功。

3 結論與討論

重金屬通過在食物鏈和飲用水中積累，對人體健康和環境造成潛在威脅[9-10]。利用現代分子生物學手段，植物修復技術治理土壤中重金屬污染，以及從源頭上控制農產品食品質量安全具有重大意義。該試驗自擬南芥種質資源中心獲得了擬南芥MNB1基因功能缺失型突變體，在前期試驗基礎上發現該突變體對鎘脅迫表現敏感。于是通過基因工程技術構建了MNB1過量表達載體，并通過浸花法轉入野生型植株中，篩選得到轉基因植株，并進一步進行篩選與鑒定，最終獲得了MNB1過表達轉基因陽性植株。這為對MNB1基因調控植物鎘耐受的機理做進一步深入研究奠定了基礎，是一項十分有意義的研究性課題。

參考文獻

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