黃鰭鯛海豚鏈球菌的分離·鑒定及藥敏試驗

王漢清 黃郁蔥 林潮峰

摘要 [目的]鑒定引起黃鰭鯛眼球充血、肝腎腫大等病征的病原菌。[方法] 從發病黃鰭鯛肝腎組織中分離致病菌，并結合致病菌的形態特征、培養特性、生理生化特征及16S RNA基因測序進行鑒定，測定分離菌株的半數致死量（LD50）；通過藥敏試驗篩選對分離菌株敏感的抗生素。[結果]經鑒定分離菌株為海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）。回歸試驗結果證實該分離菌株是引起此次黃鰭鯛發病的病原菌，其對黃鰭鯛的LD50為5.0×103 CFU/g。藥敏試驗結果表明，該分離菌株對頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢他啶和頭孢曲松等抗菌藥物有較高的敏感性。 [結論]研究結果可為黃鰭鯛海豚鏈球菌病的防治提供理論依據。

關鍵詞 黃鰭鯛；海豚鏈球菌；分離；鑒定

中圖分類號 S917.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0100-03

Abstract [Objective] To identify the pathogen that caused bloodstream congestion， hepatorenal enlargement and other symptoms in Sparus latus. [Method] The pathogen was isolated from the liver and kidney tissues of diseased S. latus. Combined with its morphological characteristics， culture characteristics， physiological and biochemical characteristics and 16S RNA gene sequencing results，the pathogen was identified. LD50 of the isolated strain was determined and the sensitive antibiotics were screened out by drug sensitivity test. [Result] The isolated strain was identified as Streptococcus iniae. The results of the regression test proved that the isolated strain was the pathogen that caused the disease of S. latus. Its LD50 to S.latus was 1.84×104 CFU/g. The results of drug sensitivity test showed that the isolated strain was highly sensitive to cefthiaxone， cefuroxime， ceftazidime， ceftriaxone， etc..[Conclusion] The research could provide theoretical basis for the prevention and control of S. suis.

Key words Sparus latus；Streptococcus iniae；Isolation；Identification

黃鰭鯛（Sparus latus）又名闊黑鯛，隸屬鱸亞目（Pencoidei）鯛科（Sparidae）鯛屬（Sparus），為淺海近岸底棲魚類，是我國海水養殖的重要品種之一，廣泛分布于我國臺灣、廣東沿海、福建、浙江，俗稱黃腳立、黃墻、赤翅等[1-3]。2017年湛江部分黃鰭鯛養殖區域暴發了以眼球充血突出、鰓蓋內緣出血、剖檢出現肝腎腫大及腹腔積液等癥狀為主要病征的疫情，傳染速度快，死亡率較高，給養殖戶造成了巨大的經濟損失。筆者對此病的病原菌開展了分離與培養，利用生化鑒定及16S RNA基因測序進行比對，測定分離菌株的LD50，通過藥敏試驗篩選敏感抗生素，旨在為黃鰭鯛的病害防治提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料及試驗魚

病料采自湛江某養殖網箱發病黃鰭鯛；回歸感染試驗所用的健康黃鰭鯛購自湛江某育苗場，無病史，平均體質量約40 g，試驗前在循環養殖系統中暫養7 d。

1.2 培養基與主要試劑

鮮血培養基、BHI培養基、新型微生物微量生化鑒定盒，購自廣東環凱微生物科技有限公司；Ex TaqDNA 聚合酶、DNA Marker2000均購自上海生工生物工程技術有限公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細菌分離及形態特征觀察

取發病養殖場具有典型病征的瀕死魚，無菌剪取少量肝腎組織接種于鮮血培養基上，28 ℃下培養18～24 h后，挑取優勢菌落劃線，分別接種于BHI平板和鮮血培養基，觀察菌落形態，挑取典型菌落進行革蘭氏染色并鏡檢。分離菌經液體培養基培養后進行菌種凍干，-80 ℃條件下保存。

1.4 細菌的生理生化鑒定

參照海豚鏈球菌的常規生理生化指標進行鑒定[4]，測定項目包括葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、松三糖、淀粉、山梨醇、阿拉伯糖、棉子糖、木糖、水楊苷、VP試驗、過氧化氫酶、鳥氨酸和賴氨酸等微量生化反應。

1.5 系統發育學分析

使用細菌16S RNA基因的通用引物進行PCR擴增，參考朱飛舟等[5]的方法。16S RNA基因擴增的的正向引物（27F）為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物為ACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR反應體系（50 μL）如下：Ex TaqDNA 聚合酶（5U/μL，含Mg2+）0.5 μL、10×PCR緩沖液5 μL、dNTP 4 μL、10 μmol/L正向引物1 μL、10 μmol/L反向引物1 μL，DNA模板1 μL，37.5 μL ddH2O。PCR反應條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共32個循環；72 ℃ 延伸7 min。PCR產物采用Gel Extraction Kit回收后，送交上海生工進行測序，測序結果經Blast分析后，構建基因進化樹。

1.6 毒力測定

將試驗黃鰭鯛（平均體質量約40 g）分為5個濃度梯度的攻毒組和1個對照組，每組試驗魚20尾。將試驗黃鰭鯛飼養在循環式養殖系統中，水溫控制在30 ℃，攻毒后飼養觀察7 d，每天記錄其游動、進食及死亡的情況。攻毒組劑量分別為1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106和1.0×107 CFU/尾，每尾腹腔注射0.1 mL；對照組注射PBS，每尾腹腔注射0.1 mL。對死亡試驗魚進行剖檢，利用改良寇氏法計算出該菌株的半數致死量（LD50）。

1.7 藥敏試驗

采用紙片擴散法（K-B法）[6]進行藥敏試驗。將新鮮培養菌液均勻涂布于BHI平板上，取妥布霉素等28種常見抗生素藥敏紙片均勻貼于平板表面，置于28 ℃培養箱中培養18～24 h，測量記錄平板上抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 發病癥狀與流行情況

發病魚水面打轉、眼球充血突出，鰓蓋內緣出血，鰭基出血，肛門發紅，鰓貧血；解剖腹腔有腹水，肝腎腫大、充血；腸道充血，內有透明積液；腦部充血或出血。該病于5月份開始發病，流行范圍廣，傳染性強，發病率和死亡率高，6—7月水溫升高至30 ℃以后死亡率為50%～80%，給養殖業造成嚴重的經濟損失。

2.2 分離菌的形態特征

從患病魚的潰瘍分離到1株優勢菌株，命名為ALZJ07株。在BHI培養基上28 ℃培養24 h的菌落呈乳白色、表面光滑、圓形，中央隆起，直徑約0.7 mm（圖1）；在新鮮血瓊脂平板上28 ℃下培養24 h的菌落呈β溶血、圓形、表面光滑的露珠樣，直徑約0.7 mm（圖2）。革蘭氏染色鏡檢呈革蘭氏陽性球菌，多數呈鏈狀排列，亦有單個或成對排列。

2.3 分離菌的生理生化特性

由表1可知，ALZJ07菌株可發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、松三糖和淀粉，不發酵山梨醇、阿拉伯糖、棉子糖、木糖、水楊苷，VP試驗、過氧化氫酶反應和H2S反應呈陰性，鳥氨酸和賴氨酸呈陰性，精氨酸雙水解酶顯示為陽性等，基本符合海豚鏈球菌的生化特性。

2.4 系統發育樹分析

為進一步確定該分離菌株ALZJ07的分類地位，測定其16S RNA的序列。經過Blast分析發現，ALZJ07與海豚鏈球菌的序列同源性在99%以上，根據測定ALZJ07所得的16S RNA基因序列與相關屬種16S RNA基因序列構建系統發育樹，可見ALZJ07與海豚鏈球菌聚為一支（圖3），說明其與海豚鏈球菌的親緣關系最近，可將ALZJ07確定為海豚鏈球菌。

2.5 毒力測定

根據攻毒后試驗魚死亡統計結果，進行LD50測定，測定結果見表2。根據測定結果，計算出ALZJ07菌株的LD50為5.0×103 CFU/g。對發病死亡的試驗魚進行外觀檢查和剖檢，主要病變為鰓蓋內緣出血，鰭基出血；解剖腹腔有腹水，肝腎腫大，腸道充血，內有透明積液。

2.6 藥敏試驗結果

采用紙片擴散法測定了病原株ALZJ07對28種不同藥物的敏感性。由表3可知，分離菌株ALZJ07對頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢他啶、呋喃妥因、頭孢曲松、左氟沙星、頭孢呱酮、青霉素G、克林霉素、麥迪霉素、頭孢唑林、四環素、氯霉素、氨芐西林、克拉霉素、氧氟沙星等高度敏感；ALZJ07對大觀霉素、環丙沙星、諾氟沙星等中度敏感；對妥布霉素、卡那霉素、鏈霉素、多黏菌素B、阿米卡星、萬古霉素、慶大霉素、氨曲南、復方新諾明等耐藥。

3 結論與討論

筆者通過對分離菌株的培養特性、形態學特征、生理生化特性、16S RNA測序分析，確定該分離菌株為海豚鏈球菌。1976年從患皮膚膿腫的亞馬遜淡水海豚中首次分離出海豚鏈球菌，20世紀90年代后虹鱒、藍子魚、羅非魚、條紋鱸、金頭鯛和牙鲆等20多種養殖和野生魚類中均有海豚鏈球菌的病例報道，認為其為引起魚類鏈球菌病的主要病原菌[7-12]。

人工感染試驗表明，分離菌株通過腹腔注射攻毒感染黃鰭鯛，感染后死亡率較高，當攻毒劑量大于1×107 CFU/尾時，試驗魚的死亡率達到100%，表明分離菌株具有較強的毒力，攻毒發病試驗魚與養殖現場觀察到發病黃鰭鯛病征一致，主要病征符合海豚鏈球菌感染的特征[13]。這說明該分離菌為引發疫情的病原菌。

藥敏試驗結果表明，分離菌株ALZJ07對妥布霉素、卡那霉素、鏈霉素、多黏菌素B、阿米卡星、萬古霉素、慶大霉素、氨曲南、復方新諾明等多種抗生素耐藥。由于水產養殖中大量使用抗生素進行疫病的防治，導致病原菌耐藥性日益增強，應該嚴格控制水產養殖中過度使用抗生素。沈錦玉等[14]應用海豚鏈球菌疫苗在大黃魚上獲得良好的免疫效果，海豚鏈球菌病的防治可以采用疫苗、有益微生物和生態防病等綜合措施。

參考文獻

[1] 朱元鼎，張春霖，成慶泰.東海魚類志[M].北京：科學出版社，1963：315-316.

[2] 許波濤.海水養魚的優良品種——黃鰭鯛[J].海洋科學，1983，7（1）：57-58.

[3] 朱麗敏，吳澤陽，張俊，等.黃鰭鯛細菌性潰瘍病致病菌研究[J].湛江海洋大學學報，1998，18（2）：5-9.

[4] 房海，陳翠珍，張曉君.水產養殖動物病原細菌學[M].北京：中國農業出版社，2010：609-610.

[5] 朱飛舟，陳利玉，陳漢春.16S rRNA基因序列分析法鑒定病原細菌[J].中南大學學報（醫學版），2013，28（10）：1035-1041.

[6] 李云章.獸醫專業畢業實習指導[M].北京：中國農業出版社，2013：73-74.

[7] 殷戰，徐伯亥.魚類細菌性疾病的研究[J].水生生物學報，1995，19（1）：76-83.

[8] WEINSTEIN M R，LITT M，KERTESZ D A，et al.Invasive infections due to a fish pathogen，Streptococcus iniae[J].N Engl J Med，1997，337（9）：589-594.

[9] ELDAR A，BEJERANO Y，BERCOVIER H.Streptococcus shiloi and Streptococcus difficile：Two new streptococcal species causing a meningoen cephalitis in fish[J].Curr Microbiol，1994，28（3）：139-143.

[10] PERERA R，JOHNSON S，COLLINS M，et al.Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica and T.aurea hybrids [J].Journal of aquatic animal health，1994，6（4）：335-340.

[11] PIER G，MADIN S.Streptococcus iniae sp.nov.，a betahemolytic streptococcus isolated from an Amazon fresh water dolphin，Inia geoffrensis[J].Int J Syst J Syst Bacteriol，1976，26（4）：545-553.

[12] ELDAR A，PERL S，FRELIER P E，et al.Red drum Sciaenops ocellatus mortalities associated with Streptococcus iniae infection[J].Dis Aquat Org，1999，36（2）：121-127.

[13] EVANS J J，SHOEMAKER C A，KLESIUS P H.Distribution of Streptococcus iniae in hybrid striped bass（Morone chrysops×Morone saxatilis）following nare inoculation[J].Aquaculture，2001，194（3/4）：233-243.

[14] 沈錦玉，許文軍，尹文林，等.哈維氏弧菌滅活疫苗在養殖大黃魚中的應用與評價[J].大連海洋大學學報，2010，25（3）：210-213.