基于生物傳感器的動物源性制品中抗生素殘留檢測技術新進展

馬文娟　姜金融

摘要 動物源性制品中抗生素殘留給人類健康和環境帶來巨大危害，生物傳感器具有檢測快、靈敏度高、便攜等優勢，在抗生素殘留檢測領域有很大的發展潛力。著重介紹了基于分子識別元件和轉換元件的不同類型生物傳感器以及其在動物源性制品中抗生素殘留檢測方面的應用，納米材料的摻入為新型生物傳感器的開發提供了有效途徑，并展望了未來的發展方向。

關鍵詞 生物傳感器；動物源性制品；抗生素殘留；檢測技術

中圖分類號 S851.34+7 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）18-0022-03

Recent Advances of Antibiotic Residues Detection Technology in Animalderived Food Based on Biosensor

MA Wenjuan，JIANG Jinrong （Gansu Institute of Business and Technology Gansu Zhongshang Food Quality Test and Detection Co.， Ltd.，Lanzhou，Gansu 730010）

Abstract Antibiotic residues in animalderived food cause great harm to human health and the environment.Biosensors have the advantages of rapid detection， high sensitivity and portability， and have great potential for development in the field of antibiotic residue detection. The different types of biosensors based on molecular recognition elements and conversion elements and their application in the detection of antibiotic residues in animal origin products had been emphatically introduced. The incorporation of nanomaterials provided an effective way for the development of new biosensors， and future development trends of biosensors were also discussed.

Key words Biosensors；Animalderived food；Antibiotic residues；Detection technology

隨著物質消費和生活水平的不斷提高，人們對動物源性制品的需求也日益增長，特別是對動物源性制品的質量和安全問題尤為關注。抗生素被廣泛用于動物疾病的治療和預防，甚至被作為飼料添加劑來提高畜禽的產量，這極大地增加了抗生素在動物源性制品中殘留的風險。抗生素殘留會對動物和人類健康產生嚴重威脅，例如會造成人體超敏反應、產生耐藥性等一系列問題[1]。基于這些不利因素，許多國家專門立法來保護消費者免受動物源性制品中獸藥和抗生素殘留帶來的危害，并且規定了最高殘留限量（maximum residue limits，MRLs），將殘留檢測列入國家監督管理計劃。

許多學者致力于研究動物源性制品中抗生素殘留檢測技術，目前主要常規方法包括微生物法、免疫學方法、儀器分析法等。微生物法是基于細菌對抗生素的敏感性[2-3]；免疫學方法基于抗原-抗體間特異的識別[4-5]；儀器分析是目前抗生素殘留定量檢測的主要手段，包括液相色譜（liquid chromatography，LC）和氣相色譜（gas chromatography，GC）技術，以及將它們與質譜聯用進行分析的技術[6-8]。這些常規的分析方法一般要涉及到樣品的前處理等步驟，操作費時、繁瑣。隨著新興技術的不斷發展，生物傳感器被應用于食品中抗生素殘留的檢測及其他領域具有非常廣闊的應用前景。基于某種特異性反應的生物傳感器主要由生物分子識別元件和轉換元件組成，可以識別目標分析物并轉化為光電信號[9]。生物傳感器用于動物源性制品中抗生素殘留的檢測，在保持了特異性強、靈敏度高優勢的同時，簡化了分析過程，并且傳感器體積小，便于攜帶，可滿足實時檢測的新要求。筆者著重介紹了基于分子識別元件和轉換元件的不同類型生物傳感器及其在動物源性制品中抗生素殘留檢測方面的應用。

1 基于不同分子識別元件的生物傳感器

生物受體是具有生物化學識別機制的有機分子物質（如抗體、酶、蛋白質或核酸）或生物體系（如細胞、組織或整個生物體）[10]。生物傳感器以這些受體作為分子識別元件，與目標分析物特異性結合從而實現信號檢測。根據生物傳感器中分子識別元件的不同可分為酶傳感器、免疫傳感器、細胞傳感器、分子印跡聚合物傳感器和適體傳感器5類。不同類型生物受體傳感器的優缺點如表1所示。

1.1 酶傳感器

在酶傳感器中酶主要被作為功能性標記物，其識別抗生素物質的原理主要基于2種檢驗機制，第1種機制是對目標分析物的催化轉化，第2種機制是對可抑制酶活性的分析物進行檢測。酶傳感器利用特異性的酶來實現對分析物的捕獲和催化，然后用換能器進行直接測定。目前，酶傳感器在抗生素殘留檢測方面的應用較少。Kiran 等[11]將青霉素酶固定在pH電極上開發了一種用于青霉素檢測的傳感器，該傳感器濃度響應范圍為10-10～10-4mol/L，初始響應時間為20～30 s。

1.2 免疫傳感器

免疫傳感器是利用抗體與抗原間的特異性識別功能而研制的生物傳感器，抗體通常被固定于檢測器表面，抗體的類型可以是多克隆、單克隆或取決于它們的選擇特性及合成方式。目前，抗體作為生物傳感器的主要受體已經在分析領域得到廣泛應用，特別是動物源性制品中抗生素殘留檢測。Tochi等[12]利用碳二亞胺活性酯法合成恩氟沙星（ENFX），接種雄性小鼠產生ENFX單克隆抗體，該抗體對ENFX具有高靈敏性和特異性，最低檢測量達0.028 ng/mL。Pinacho等[13]利用電磁免疫傳感器檢測牛奶中氟喹諾酮類抗生素，將可識別氟喹諾酮類抗生素的半抗原酶與磁珠結合，可直接對樣品進行定量測定。酶聯免疫吸附測定法（ELISA）通常側重于檢測單個分析物，Jiang 等[14]通過雙比色酶聯免疫吸附測定法同時對牛奶中13種氟喹諾酮類和22種磺酰胺類抗生素殘留進行測定，且檢出限分別達2.4和5.8 ng/mL，該方法為高通量檢測多種抗生素提供了有效途徑。

1.3 細胞傳感器

細胞傳感器以活細胞作為分子識別元件。一些含有由啟動子誘導的報告基因的單細胞微生物被用于全細胞生物傳感器的開發，在目標分析物存在的情況下，誘導基因被激活從而導致報道基因表達或抑制，這一過程可轉化為光信號被測量，基于光學檢測的微生物細胞傳感器可同時對多種分析物進行檢測[15-16]，這也是一種利用DNA重組技術構建的微生物細胞用于抗生素殘留檢測的新型傳感器[17]，全細胞生物傳感器可分為組成型和誘導型[18]。Cheng等[19]構建了一個含有質粒pRecAlux3的轉基因菌種pK12，其響應目標分析物的機理是基于誘導存在于質粒pRecAlux3上的recA啟動子融合的熒光素酶報告基因，該傳感器可檢測二氟沙星、恩氟沙星、環丙沙星等11種氟喹諾酮類抗生素，可應用于多種動物源性制品的檢測。

1.4 分子印跡聚合物傳感器

分子印跡聚合物傳感器是以一些天然化合物或合成化合物模擬的生物體系作為分子識別元件，分子印跡聚合物敏感材料與近年來研究較熱的生物敏感材料相比，具有耐高溫、高壓、酸、堿和有機溶劑，不易被降解破壞，可重復使用，易于保存等優點[20]。Karaseva等[21]以納米顆粒分子印跡聚合物（NMIP）作為分子識別元件用于檢測青霉素，通過沉淀聚合的方式獲得NMIP，并在壓電傳感器的表面形成受體層。Luo等[22]則以納米分子印跡聚合物（MIP）為分子識別元件開發了表面等離子體共振（SPR）傳感器， MIP-SPR傳感器對環丙沙星具有高選擇性、高靈敏度和良好的穩定性。

1.5 適體傳感器

適體是經體外篩選技術篩選出的能特異性結合蛋白質或其他小分子物質的寡聚核苷酸片段（RNA或單鏈DNA），適體與分析物靶分子的結合方式與抗原-抗體作用機理相似，與免疫傳感器相比，適體具有靶分子范圍廣、與配體作用親和力高、特異性強、高度穩定性、制備方法簡單等優勢[23]。近年來，已經開發了多種類型的適體傳感器對動物源性制品中的抗生素殘留物進行檢測，如氯霉素[24-25]、卡那霉素[26]、達氟沙星[27]等。仿生生物傳感器與傳統受體生物傳感器相比具有體外制備的優點，分子印跡聚合物和適體傳感器的商業化正處于起步階段，未來有很好的應用前景。

2 基于不同轉換元件的生物傳感器

2.1 電化學生物傳感器

對于電化學生物傳感器的開發與應用研究已近60年，由于其應用范圍廣，易商業化，未來還有很大的發展潛力。電化學生物傳感器的工作原理是固定化的生物分子與分析物發生化學反應產生或消耗電子，這種化學反應信息可被電位計、電流計或阻抗傳感器轉換成可測量分析的電信號[28]。近年來，以適體為分子識別元件的電化學生物傳感器在動物源性食品抗生素殘留檢測方面得到了廣泛應用[29-30]。納米材料的引入使得電化學生物傳感器響應速度更快，靈敏度更高。Qin等[31]以石墨烯和納米合金為傳感材料，制備了一種用于定量檢測卡那霉素的超敏電化學適體傳感器，在最優系統條件下具有廣泛的線性范圍（5×10-7～5×10-2 μg/mL）、較低的檢測限（4.2×10-7μg/mL）。

2.2 質量感應生物傳感器

質量感應生物傳感器可以響應單位時間內通過的溶質質量，其質量敏感元件一般基于壓電材料和表面聲波技術。壓電效應是某些壓電材料（如晶體、陶瓷、高分子材料等）中的電荷對加載壓力的響應，其中應用較多的是石英晶體微天平，一種可將不易測得的生化信號轉化為頻率信號的超敏質量傳感器（ng級）[32]。Ebarvia等[33]開發了一種基于MIP生物識別的QCM生物傳感器，該傳感器可以在低于MRPL的濃度下檢測豬肉、牛奶、蜂蜜和蝦中的氯霉素。表面聲波傳感器根據不同的波型分類，主要包括瑞利波、樂甫波等[34]。Gruhl等[35]首次將表面聲波（SAW）生物傳感器用于牛奶中青霉素G的快速無標記檢測。

2.3 光學生物傳感器

光學生物傳感器以被測物質與生物受體發生反應所引發的光信號為檢測基礎，根據光學原理的不同可分為時間分辨熒光分析（TR-FIA）、表面等離子共振（SPR）、流式細胞免疫分析（FCIA）、 化學發光免疫分析（CLIA）等。Zhou等[36] 采用時間分辨熒光分析技術檢測蜂蜜、蝦、雞肉等食品中氯霉素的殘留情況，檢測范圍為0.008～100.000 μg/L。Pan等[37]開發的SPR芯片可檢測常見動物源性食品中4種磺胺類抗生素，具有較高的準確度和靈敏度，每個檢測周期可以在5 min內完成。Evidence investigator system是基于化學發光免疫分析開發的生物芯片，目前已商業化，可對肉制品中喹諾酮類、頭孢噻呋、甲砜霉素、鏈霉素、泰樂菌素和四環素6類抗生素進行檢測[38]。

3 基于納米材料的生物傳感器

納米材料的摻入可以增加響應速度、選擇性和靈敏度，許多納米材料如金屬納米材料、二氧化硅納米顆粒、碳納米材料等已用于生物傳感器的構建[39]。近年來，學者們基于納米材料開發了熒光生物傳感器、比色生物傳感器、表面等離子體共振生物傳感器等應用于動物源性食品中抗生素殘留的檢測，為生物傳感器的小型化和抗生素殘留檢測的快速化提供了有效途徑。Ramezani等[40]設計了納米金顆粒（AuNPs）和FAM標記的熒光適體傳感器，用于檢測牛奶和血清中的氨基糖苷類抗生素，對卡那霉素和慶大霉素具有高選擇性，其中對卡那霉素的檢測限（LOD）低至3.21×10-4 μmol/L。Sari等[41]結合微乳液聚合、分子印跡和SPR技術開發了一種基于分子印跡納米顆粒快速檢測紅霉素的SPR生物傳感器，線性范圍和檢測限分別為0.99（R2）和0.29 μg/mL。然而，與其他傳感器的應用相比，生物傳感器在抗生素殘留檢測領域的應用還處于相對不成熟的階段，許多技術障礙需要解決，包括納米材料與生物識別分子的相容性、非均質納米材料對傳感器性能的影響，以及納米分子、生物識別分子和抗生素分子間的交叉干擾等問題。

安徽農業科學 2018年

4 展望

與傳統方法相比，生物傳感器無需樣品前處理，具有檢測快、成本低、便攜的優點，分子識別元件、轉換元件、納米技術依然是未來生物傳感器發展的主要方向。動物源性制品中抗生素殘留給人類健康和環境帶來巨大威脅，實現抗生素殘留高通量、實時快速檢測是未來生物傳感器發展的新要求。到目前為止，大多數新型傳感器的應用僅限于實驗室規模，因此，開發出能夠實現快速生產高質量且成本相對較低的生物傳感器技術是亟待解決的創新課題，這種技術是任何生物傳感器成功商業化應用的先決條件。今后的工作重點應放在開發多功能納米材料、強化納米材料與分子識別元件及轉換元件間的應用兼容性，使抗生素生物傳感器更加完善，未來在抗生素殘留檢測方面發揮重要作用。

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