響應(yīng)面法優(yōu)化芥菜芽苗富集異硫氰酸酯發(fā)芽條件

尹永祺　齊菲　王淑雯　史穎悟　方維明　高璐　饒勝其　楊振泉

摘要 [目的]優(yōu)化芥菜芽苗發(fā)芽條件以富集異硫氰酸鹽含量。[方法]以芥菜為試材，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗研究發(fā)芽時間、光照時間和發(fā)芽溫度對芥菜中異硫氰酸酯含量的影響并對其進行優(yōu)化。[結(jié)果]建立的回歸模型顯著，可用于預(yù)測異硫氰酸酯富集培養(yǎng)條件，各因素對芥菜中異硫氰酸酯含量影響為發(fā)芽時間>光照時間>發(fā)芽溫度，經(jīng)模型預(yù)測并驗證得到芥菜發(fā)芽富集異硫氰酸酯的最佳條件為發(fā)芽時間4.8 d、光照時間17.4 h、發(fā)芽溫度30.7 ℃，在該條件下芥菜中異硫氰酸酯含量可達（721.9±8.9）mg/kg。[結(jié)論]該研究結(jié)果為芥菜芽苗類功能食品的開發(fā)利用提供了參考。

關(guān)鍵詞 芥菜芽苗；異硫氰酸酯；響應(yīng)面法；培養(yǎng)條件

中圖分類號 S-03 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）13-0167-03

Optimization of Germination Conditions for Accumulating Isothiocyanate in Germinated Brassica juncea by Response Surface Methodology

YIN Yongqi，QI Fei，WANG Shuwen et al

（College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225127）

Abstract [Objective] The aim was to optimize germination conditions for accumulating isothiocyanates in germinated Brassica juncea.[Method] The effects of germination time，light time and germination temperature on the accumulation of isothiocyanates in germinated Brassica juncea were studied.[Result] The factors arranged in important order as followed：germination time，light time and germination temperature.The optimum conditions for accumulating isothiocyanates in germinated Brassica juncea were germination time of 4.8 d，light time of 17.4 h and germination temperature of 30.7 ℃. Under the optimal conditions，the predicted highest content of isothiocyanates in germinated mustard was （721.9±8.9）mg/kg. [Conclusion] The result provides reference for development and utilization of functional food of mustard sprout.

Key words Germinated mustard；Isothiocyanates；Response surface methodology；Culture condition

植物體內(nèi)異硫氰酸酯類物質(zhì)（Isothiocyanates，ITCs）是硫代葡萄糖苷經(jīng)黑芥子酶（Myrosinase，MYR，EC 3.2.1.147）作用下形成的水解產(chǎn)物[1]，其具抗氧化、殺菌與抗癌等多種生理功效[2-3]。由于蘿卜硫素等ITCs具有多種抑瘤功能且分子量小、治療效果好等優(yōu)點，已成為重點研究的抗腫瘤藥候選藥物，其可通過抑制 Ⅰ 相酶和誘導(dǎo) Ⅱ 相解毒酶活性從而預(yù)防和治療多種惡性腫瘤[4-5]。研究證實甘藍、花椰菜和芥菜等蕓薹屬蔬菜中ITCs含量較高，因此，包括西蘭花和甘藍等多種蕓薹屬蔬菜的抗癌保健功能及其產(chǎn)品開發(fā)日益受到人們關(guān)注[3]。芥菜（Brassica juncea L.）作為我國特產(chǎn)蔬菜，是蕓薹屬一年生或二年生草本植物，其在我國栽培歷史悠久，分布地區(qū)廣泛，是大宗消費與加工的蔬菜之一[6]。然而，目前我國芥菜多數(shù)僅用于生產(chǎn)脫水蔬菜、腌制蔬菜等初級加工品，也有用其制作發(fā)酵型芥菜汁和凈菜等，精深加工產(chǎn)品較少。利用我國芥菜資源富集其中ITCs可有效提高芥菜蔬菜加工利用水平，提升產(chǎn)品的市場競爭力。

植物籽粒發(fā)芽后其硫代葡萄糖苷含量顯著增加，同時發(fā)芽期間其內(nèi)源黑芥子酶被激活，因此，通過控制發(fā)芽條件以富集蕓薹屬蔬菜中ITCs已成為一種行之有效的方法[7-8]。筆者以我國特產(chǎn)蔬菜芥菜為試材，研究了發(fā)芽時間、光照時間和發(fā)芽溫度等發(fā)芽條件對芥菜中ITCs含量的影響，并通過響應(yīng)面法對其發(fā)芽條件進行了優(yōu)化，以期獲得芥菜發(fā)芽富集ITCs的最佳培養(yǎng)條件，為芥菜芽苗類功能食品的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。浙江榨菜為嘉興先豐種業(yè)有限公司產(chǎn)品，購于2015年，封裝于密閉容器中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑。1，2-苯二硫醇（色譜純）為東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品；蘿卜硫素為美國Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3

儀器。ZSD-1270生化發(fā)芽箱，沈陽奇特爾科技有限公司；PJX-250D光照發(fā)芽箱，金壇市水北科普實驗儀器廠； HC-2066高速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DHZ-C大容量恒溫振蕩器， 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠； UV-7504c 紫外可見分光光度計，上海啟威電子公司；DGX-2電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海福碼實驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芽苗培養(yǎng)。

取浙江榨菜種子，置于1%NaClO水溶液中浸泡消毒15 min，用蒸餾水沖洗至pH中性，后于蒸餾水中30 ℃浸泡4 h，置于鋪有蛭石的小盒中，置于發(fā)芽機培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，定時光照，催芽1 d后，停止噴霧，其后每天噴1次去離子水。芽苗長成后，取樣，用蒸餾水清洗芽苗，吸干表面水分，保鮮膜包好后于液氮中速凍，于-20 ℃保藏，待測。

1.2.2 單因素試驗。按照 “1.2.1” 方法，保持其他條件不變，分別研究發(fā)芽時間、光照時間和發(fā)芽溫度對芥菜芽苗ITCs含量的影響。

1.2.2.1 發(fā)芽時間。固定發(fā)芽溫度為30 ℃，光照時間為16 h，暗處理8 h，分別發(fā)芽4、5、6、7和8 d，取樣測定芽苗ITCs含量。

1.2.2.2 光照時間。固定發(fā)芽溫度為30 ℃，發(fā)芽期間每天分別光照0、8、16和24 h，發(fā)芽5 d后取樣測定芽苗ITCs含量。

1.2.2.3 發(fā)芽溫度。每天固定光照時間為16 h，暗處理8 h，分別置于24、27、30和33 ℃下發(fā)芽，發(fā)芽5 d后取樣測定芽苗ITCs含量。

1.2.3 響應(yīng)面試驗。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的Box-Behnken設(shè)計，考察發(fā)芽時間、光照時間和發(fā)芽溫度3個因素對ITCs含量的影響，試驗因素與水平見表1，以ITCs含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)條件，采用Design-expert 8.0.6對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，建立二次線性回歸方程，預(yù)測最佳工藝參數(shù)。

1.2.4 ITCs的提取與測定。參照Guo等[9]的方法進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各指標測定重復(fù)3次，以“平均值±標準差”表示。采用Duncans多重比較進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

由圖1可知，隨著發(fā)芽時間的延長，ITCs含量呈先上升后下降的趨勢，發(fā)芽5 d時ITCs含量顯著高于其他發(fā)芽時間，同樣隨著光照時間和發(fā)芽溫度的增加，芥菜中ITCs含量均呈先上升后下降趨勢。選擇發(fā)芽時間5 d，每天光照16 h和發(fā)芽溫度30 ℃進一步優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面模型的建立與方差分析 Box-behnken試驗設(shè)計組合及結(jié)果見表2。利用Design Expert 8.0.6軟件進行二次多元回歸擬合，得到描述ITCs含量與自變量發(fā)芽時間

（A）、光照時間（B）和發(fā)芽溫度（C）的二次多項回歸擬合

2.3 響應(yīng)面模型方差分析

對響應(yīng)面模型進行方差分析，響應(yīng)曲面模型的P<0.000 1說明擬合的模型極顯著，且失擬項P=0.100 1>0.05，表明該模型可用于進行數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計且98.91%的數(shù)據(jù)可以用該模型解釋（R2=0.989 1）；同時A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2均具有顯著性。各因素變化情況如圖2所示。

按照最優(yōu)條件進行驗證，芥菜在30.7 ℃下發(fā)芽4.8 d，光照時間為17.4 h時，芽苗中ITCs含量為（721.9±8.9） mg/kg。

3 結(jié)論

以芥菜為試材優(yōu)化其培養(yǎng)條件，以富集芽苗中ITCs，發(fā)芽時間、光照時間和發(fā)芽溫度對于芽苗中ITCs含量均具有顯著影響，該研究構(gòu)建的二次回歸模型適用于預(yù)測芥菜芽苗培養(yǎng)期間的ITCs含量，優(yōu)化得出將芥菜籽粒在30.7 ℃下發(fā)芽4.8 d，每天光照時間17.4 h時，芥菜芽苗中ITCs含量含量為（721.9±8.9）mg/kg。

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