大鼠MKK3蛋白的生物信息學(xué)分析

趙小峰　吳桂梅　金磊　汪瑤　賀玲

摘要 [目的] 對(duì)大鼠MKK3蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測其結(jié)構(gòu)和功能，可以為進(jìn)一步研究大鼠MKK3蛋白的功能提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。[方法] 利用生物信息學(xué)工具對(duì)大鼠MKK3蛋白的理化性質(zhì)、跨膜區(qū)域、空間結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、相互作用等進(jìn)行預(yù)測。[結(jié)果] 大鼠MKK3蛋白由347個(gè)氨基酸殘基組成，等電點(diǎn)為7.05，相對(duì)分子質(zhì)量39.3 kD，在哺乳動(dòng)物中高度保守。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲構(gòu)成，結(jié)構(gòu)上含一個(gè)S_TKc結(jié)構(gòu)域。MKK3能與多種MAPK、Tab1、Tab2、Traf6等蛋白發(fā)生相互作用。[結(jié)論] 大鼠MKK3蛋白是一種不含信號(hào)肽和跨膜區(qū)的親水蛋白，具有激酶活性，可參與p38MAPK信號(hào)通路在炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。該研究為進(jìn)一步研究大鼠MKK3蛋白的功能提供了試驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 大鼠；MKK3；序列分析；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào) Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）13-0114-04

Bioinformatic Analysis of Rat MKK3 Protein

ZHAO Xiaofeng，WU Guimei，JIN Lei et al

（National Demonstration Center for Experimental Basic Medical Science Education， Xuzhou Medical University，Xuzhou，Jiangsu 221004）

Abstract [Objective]To predict the structure and function of rat MKK3 protein with bioinformatics.[Method] The bioinformatic tools were used to predict physical and chemical properties， transmembrane region，spatial structure，phosphorylation sites and proteinprotein interaction of MKK3 protein.[Result]Rat MKK3 contained 347 amino acid residues，the theoretical isoelectric point was 7.05，the calculated molecular mass was 393kD， and it was highly conservative in mammal. The signal peptide and transmembrane regions were not found in rat MKK3. The main compositions of protein secondary structure were alphahelix ，betaextended strand and random coil， which contained one S_TKc domain. The proteins interaction with rat MKK3 were MAPK，Tab1，Tab2，Traf6.[Conclusion]Rat MKK3 protein is a hydrophilic protein without signal peptide and transmembrane regions， the protein acts as protein kinases and involves in the activation of p38 MAPK signal pathway may play an important role in inflammation injury and tumor progress.Our research can provide useful information for the further study of rat MKK3.

Abstract Rattus norvegicus；MKK3；Sequence analysis；Bioinformatic analysis

絲裂原活化蛋白激酶激酶3（Mitogenactivated protein kinase kinase 3，MAP2K3，MKK3）是雙重特異性蛋白激酶（dualspecificity protein kinase group， DSK）家族成員， 也是p38MAPK信號(hào)通路的重要成員。在不同應(yīng)激和炎癥因子刺激作用下，上游的轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1（TAK1）、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1） 等MKKK激酶通過Ser 189和Thr 193磷酸化激活MKK3[1-3]，MKK3進(jìn)一步活化p38進(jìn)而激活p38MAPK信號(hào)通路，參與細(xì)胞的分化、運(yùn)動(dòng)、分裂、死亡等過程。一系列研究發(fā)現(xiàn)MKK3也參與腫瘤的浸潤和進(jìn)展[4-6]。表明MKK3對(duì)炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)展起重要作用。目前MKK3激酶在p38 MAPK信號(hào)通路中如何與其他蛋白相互作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。為進(jìn)一步闡明MKK3在p38 MAPK信號(hào)通路中的組裝及作用機(jī)制，筆者對(duì)大鼠MKK3蛋白進(jìn)行生物信息分析，為研究MKK3在p38 MAPK信號(hào)通路中的組裝及作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 登錄NCBI 主頁進(jìn)入GenBank 下載大鼠和其他物種MKK3的基因和蛋白序列。

1.2 方法

以大鼠MKK3的基因和蛋白序列為材料，應(yīng)用在線軟件ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析MKK3蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)（pI）、

原子組成、穩(wěn)定性、半衰期、疏水性。采用SignalP 4.1軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預(yù)測MKK3蛋白是否含有信號(hào)肽。利用NetPhos 2.0 軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）對(duì)MKK3蛋白進(jìn)行分析，判斷蛋白是否含有磷酸化位點(diǎn)。通過GORⅣ、SMART軟件預(yù)測MKK3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[7]。采用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de）、EXPASY （http：//swissmodel.expasy.org/）軟件分析蛋白質(zhì)的功能域和三級(jí)結(jié)構(gòu)。之后利用STRING數(shù)據(jù)庫研究相關(guān)蛋白之間的相互作用，最后應(yīng)用MEGA5 軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)和分子進(jìn)化分析[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠MKK3蛋白的理化性質(zhì)分析

采用在線軟件ProtParam分析大鼠MKK3蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示該蛋白由347個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量39.3 kD，分子式C1747H2783N473O516S20，pI為7.05。帶正電荷的氨基酸殘基（賴氨酸+精氨酸）46個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基 （谷氨酸+天冬氨酸） 46個(gè)。估計(jì)MKK3蛋白在哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)（Ⅱ）是47.70，根據(jù)不穩(wěn)定指數(shù)的判斷標(biāo)準(zhǔn)：小于40被認(rèn)為是穩(wěn)定，高于40為不穩(wěn)定[9]，推定MKK3蛋白屬于非穩(wěn)定蛋白。

2.2 大鼠MKK3蛋白的親水性/疏水性分析

利用ProtScale 程序?qū)Υ笫驧KK3蛋白的親疏水性進(jìn)行在線分析，結(jié)果如圖1所示，該蛋白存在3個(gè)高分值（score>1.5）區(qū)，即第169、170和173位氨基酸區(qū)，第255、258～260位氨基酸區(qū)，第339位氨基酸，其中最大值是第173位的異亮氨酸（2167）。而低分值（score<0） 區(qū)較多，最小值是第20位的賴氨酸（-3.256）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，大鼠MKK3蛋白中的339個(gè)氨基酸（5～343），有63.13% （214個(gè)） 分布在低分值區(qū)，36.87% （125個(gè)） 分布在分值>0的區(qū)域，這說明大鼠MKK3蛋白存在明顯的親水域，屬親水性蛋白質(zhì)。這一結(jié)果與ProtParam程序分析得出的結(jié)果一致：大鼠MKK3蛋白脂肪族氨基酸指數(shù)83.11，總的親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.326，顯示該蛋白為親水蛋白質(zhì)。

2.3 大鼠MKK3蛋白的信號(hào)肽及核定位序列預(yù)測

利用信號(hào)肽預(yù)測服務(wù)器SignalP 4.1 Server預(yù)測大鼠MKK3蛋白的信號(hào)肽，預(yù)測結(jié)果如圖2所示，通過程序計(jì)算得出C、Y、S 的最大值分別為0.109、0.104、0.123，S-mean、D 值分別為0.099、0.101，通過這些數(shù)據(jù)可以得出大鼠MKK3蛋白無信號(hào)肽。

通過核定位序列預(yù)測系統(tǒng)cNLS-mapper 對(duì)其進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)存在2個(gè)核定位序列：①第16～45位氨基酸殘基處（score=5.2），全序列為KGKSKRKRDLRISCVSKPPVSNPTPPRNLD，②第306～334位氨基酸殘基處（score =6.1），全序列為LRKNPAERMSYLELMEHPFFTLHKTKKTD。2段核定位信號(hào)中堿性氨基酸（精氨酸+賴氨酸）的總和是15個(gè)。

2.4 大鼠MKK3蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測與分析

大鼠MKK3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)使用TMHMM程序進(jìn)行預(yù)測，通過計(jì)算得到圖3。結(jié)果顯示大鼠MKK3蛋白347個(gè)氨基酸殘基全部在膜外，不存在跨膜區(qū)域，這說明大鼠MKK3蛋白是非跨膜蛋白質(zhì)。

2.5 大鼠MKK3蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析

利用NetPhos 20、GPS 3.0程序分析大鼠MKK3蛋白的磷酸化位點(diǎn)，通過分析發(fā)現(xiàn)該蛋白可能含有53個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)26個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)18個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)9個(gè)，結(jié)果如圖4。

2.6 大鼠MKK3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用GORⅣ、SMART對(duì)大鼠MKK3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，大鼠MKK3蛋白由30.26%的α-螺旋（H）、21.33%的β-折疊（E）、48.41%的無規(guī)卷曲構(gòu)成（C）（圖5），這些構(gòu)件分布于多肽鏈不同位置，在局部形成有序結(jié)構(gòu)，有利于蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮。該蛋白在64～325位氨基酸殘基處有一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域：S_TKc domain（圖6），該區(qū)域是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，表明蛋白具有蛋白激酶活性，在信號(hào)通路中能磷酸化并激活下游靶蛋白。

2.7 大鼠MKK3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析及相互作用蛋白質(zhì)預(yù)測

將大鼠MKK3蛋白的氨基酸序列提交Swiss-Model軟件進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，得到了1個(gè)預(yù)測結(jié)果，如圖7 所示：在三級(jí)結(jié)構(gòu)中蛋白無規(guī)卷曲分布較多，而α-螺旋、β-折疊在中間區(qū)分布較集中，體現(xiàn)出蛋白功能區(qū)相對(duì)集中，有利于蛋白作用的發(fā)揮，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)中預(yù)測的結(jié)構(gòu)元件分布大致相同。

使用STRING數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測能與大鼠MKK3蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，得到了如圖8 所示的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)中標(biāo)注了前10位與大鼠MKK3相互作用緊密的蛋白質(zhì)。從圖中可以看到能與大鼠MKK3相互作用的大部分是絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）家族成員，并且這些激酶之間也存在緊密的相互作用關(guān)系。通過對(duì)這些預(yù)測結(jié)果進(jìn)行分析，可以判定大鼠MKK3蛋白的主要作用方式可能是磷酸化并激活靶蛋白，從而完成信號(hào)的傳遞。結(jié)合前面分析得到大鼠MKK3含有核定位信號(hào)，表明該蛋白有可能通過核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用，這也體現(xiàn)MAPK家族是細(xì)胞信號(hào)從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。

2.8 大鼠MKK3蛋白進(jìn)化分析

從MEGA5 軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖9） 可以看出，大鼠MKK3與小鼠、中國倉鼠距離較近，說明它們之間有高度同源性，與它們都屬于嚙齒類的動(dòng)物分類關(guān)系一致。此外，大鼠、小鼠等嚙齒動(dòng)物與人、牛、羊、豬等哺乳動(dòng)物之間的進(jìn)化距離很小，表明該蛋白在哺乳動(dòng)物之間具有很高的保守性，在哺乳動(dòng)物中可能具有相似的激酶調(diào)節(jié)功能。

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一類廣泛分布于胞漿內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在哺乳動(dòng)物中，MAPK可以被細(xì)胞內(nèi)外各種物理應(yīng)激、細(xì)胞因子、滲透壓力、毒素、電離輻射、脂多糖等刺激激活[10-11]，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長發(fā)育、存活、分裂、分化、凋亡及自噬等生命過程，同時(shí)MAPK也能活化下游蛋白激酶，參與多種細(xì)胞信號(hào)的識(shí)別、傳遞及放大等過程[12]。MAPK信號(hào)通路主要有MKK4/7-JNK信號(hào)通路、MKK3/6-p38信號(hào)通路、MEK1-ERK1/2 信號(hào)通路及MKK5/ERK5 信號(hào)通路[13]，p38 MAPK 通路是其中重要的一條信號(hào)通路。MKK3是p38上游主要的激酶，在應(yīng)激和其他刺激條件下MKK3促使p38MAPK的Thr-Gly-Tyr位點(diǎn)發(fā)生磷酸化而活化，激活的p38MAPK可將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核啟動(dòng)相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，也能將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至其他細(xì)胞組件以產(chǎn)生不同的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，siRNA敲除小鼠和骨髓源性巨噬細(xì)胞MKK3后，炎癥細(xì)胞線粒體膜電位得到提高，線粒體功能逐漸恢復(fù)[16]。在LPS誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）試驗(yàn)中，敲除MKK3后小鼠肺部的炎癥反應(yīng)減輕，線粒體內(nèi)活性氧簇也減少[17]。說明MKK3在炎癥細(xì)胞循環(huán)和線粒體活性氧損傷中發(fā)揮重要作用。近期研究還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的MKK3也是p38 MAPK的主要激活因子，MKK3的活性與p38活性密切相關(guān)，MKK3參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳腺癌細(xì)胞的侵襲和進(jìn)展[4]。Gurtner等[5]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞p53突變后能結(jié)合并激活MKK3及調(diào)節(jié)MKK3基因的表達(dá)，敲除MKK3后腫瘤細(xì)胞的增殖能力和存活率減少。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，MKK3敲除后只對(duì)野生型p53癌細(xì)胞的增殖和生長有影響，對(duì)正常細(xì)胞無影響。此外MKK3敲除還增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的生物反應(yīng)[6]。以上研究表明MKK3在應(yīng)激反應(yīng)、炎癥、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用。因此對(duì)MKK3蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分析將會(huì)對(duì)其功能有較深入的了解。

該研究利用生物信息學(xué)工具對(duì)大鼠MKK3蛋白相關(guān)信息進(jìn)行預(yù)測分析，研究發(fā)現(xiàn)大鼠MKK3蛋白是由347個(gè)氨基酸組成的無信號(hào)肽、無跨膜結(jié)構(gòu)的親水蛋白質(zhì)，推測該蛋白pI為7.05，不穩(wěn)定系數(shù)（Ⅱ）是47.70，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。大鼠MKK3二級(jí)結(jié)構(gòu)包含30.26%的α-螺旋、21.33%的β-折疊、48.41%的無規(guī)卷曲，含有53個(gè)磷酸化位點(diǎn)，能在外界刺激下發(fā)生磷酸化而被激活。在64～325位氨基酸殘基處有一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域：S_TKc domain，說明該蛋白具有激酶活性，能通過蛋白激酶活性使與之結(jié)合的MAPK、Tab1、Tab2、Traf6等活化，調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路的信息傳遞，從而調(diào)節(jié)機(jī)體正常生理和病理過程。因此，利用生物信息學(xué)方法得到大鼠MKK3蛋白的預(yù)測結(jié)果，對(duì)深入研究大鼠MKK3在p38 MAPK信號(hào)通路中的組裝及尋找新的治療靶點(diǎn)具有積極指導(dǎo)意義。

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