雜交水稻稻曲病原真菌的分離與鑒定

左山 張沫雨 劉雯滍 黎妮 王偉平

摘要 [目的]分離獲得與鑒定引發雜交水稻稻曲病的病原真菌。[方法]通過微生物培養方法及多相分類鑒定技術，對引發雜交水稻稻曲病害的病原真菌進行分離與鑒定。[結果]該研究分離獲得了引發稻曲病病害的絕對優勢病原菌種，并鑒定為稻綠核菌（Ustilaginoidea virens）。[結論]該研究為進一步防治水稻稻曲病病原真菌與減少稻曲病病害發生奠定了科學基礎。

關鍵詞 雜交水稻；稻曲病；病原真菌；稻綠核菌

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）13-0108-03

Separation and Identification of Pathogenic Fungus of False Smut in Rice from Hybrid Rice

ZUO Shan1，ZHANG Moyu1，LIU Wenzhi1 et al

（1.Beijing Guangqumen High School，Beijing 100062；2.State Key Laboratory of Hybrid Rice （Hunan Hybrid Rice Research Center），Changsha，Hunan 410125）

Abstract [Objective] To isolate and identify the pathogenic fungi that would cause hybrid rice false smut.[Method]To isolate and identify the pathogen strains of false smut from hybrid rice by the methods of microorganism cultivation and polyphasic taxonomic technology. [Result] In this study，the absolutely dominant pathogenic bacteria that caused the disease of rice smut was isolated and identified as Ustilaginoidea virens.[Conclusion] This study laid a scientific foundation for further prevention and control on rice fungal pathogens and reduction of rice smut disease occurrence.

Key words Hybrid rice；False smut in rice；Pathogenic fungi；Ustilaginoidea virens

水稻稻曲病（Rice false smut）廣泛分布在美洲、非洲和亞洲等地區，其中在我國發生突出。在我國南方稻區，由于夏秋陰雨天氣頻發，中晚稻生產稻曲病發生較重，對水稻產量和品質均造成了較大損失。稻曲病主要由病原真菌侵染水稻稻穗，形成大于谷粒數倍的菌絲球即稻曲球，且表面覆蓋大量的黃色或墨綠色的厚垣孢子，稻曲球不但嚴重威脅水稻產量和質量，而且能產生對人和牲畜有劇毒作用的真菌毒素，因此進行稻曲病的防治尤為重要[1-7]。

目前稻曲病的防治主要依賴于化學藥品，其對環境污染較為嚴重，生物防治方法有待進一步開發研究。筆者從雜交水稻稻曲病發生地采集了大量的稻曲球，對稻曲病原菌進行分離和鑒定，并進行菌種保藏，以期為生防菌劑的開發奠定微生物生態學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 雜交水稻稻曲病發病種子（稻曲球）由湖南雜交水稻研究中心提供，品種為“深兩優5814”，于2016年9月采集，地理坐標為112°73′36″E、25°73′08″N。將采集樣品置于4 ℃保存。

1.2 培養基及試劑

玫瑰紅鈉和PDA成品培養基購自北京陸橋公司；基因組DNA快速提取試劑盒購自美國OMEGA公司；PCR相關試劑購自TIANGEN公司；PCR引物由上海生工合成。

1.3 稻曲病病原真菌的分離培養與形態學觀察

選取10顆發病種子，用無菌鑷子和刀片刮取種子表面的發病組織于無菌水中，然后依次用無菌水稀釋成濃度為10-1、10-2、10-3的組織懸液。分別取100 μL懸液涂布于玫瑰紅鈉平板上（平板含有25 mg/mL氯霉素和25 mg/mL四環素），每個處理3個平行。將玫瑰紅鈉平板置于25 ℃培養箱培養，從第2天開始對平板上的單菌落進行分離計數，共7 d，根據菌落形態（包括大小、形狀、顏色、質地、有無滲透液，有無可溶性色素等）對可培養真菌進行初篩，利用PDA培養基平板純化菌株。將純化好的菌株用試管保藏備份。

1.4 病原真菌的分子生物學鑒定

利用基因組DNA提取試劑盒提取真菌基因組DNA，采用通用引物LR0R （5′-GTACCCGCTGAACTTAAGC -3′）和LR5 （5′-ATCCTGAGGGAAACTTC -3′）擴增菌株26S rDNA 序列[8]。PCR 反應體系：模板10×PCR buffer 5 μL、dNTP （2.5 mmol/L） 4 μL、模板 2 μL、Taq DNA 聚合酶 1 μL、引物各 1 μL，補充去離子水至50 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，53 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，33個循環；72 ℃ 7 min。PCR 產物用1%凝膠電泳進行檢測并送交上海生工生物工程有限公司測序，PCR 產物用1%凝膠電泳進行檢測并送交上海生工生物工程有限公司測序，將測序序列提交至GenBank。

將序列在NCBI核酸數據庫中進行Blast比對，選取相近種的模式菌株序列作為內群，選取1個與待測菌株同科不同屬的模式菌株序列作為外群，利用ClustalX （1.83）軟件進行序列比對分析，采用MEGA5.0軟件，鄰接法（NJ）構建系統發育樹，Kimura 2-parameter模型計算進化距離，進行1 000次的相似度重復計算檢驗[9]。

2 結果與分析

2.1 分離培養結果

3個稀釋度共得到約1×103個菌落，形態學初篩大部分菌落形態特征完全相同，為絕對優勢種，判定該優勢種為稻曲病主要病原菌，隨機挑取6個優勢菌菌落進行分純，并保藏于PDA試管斜面中，原始編號分別為RSF1～RSF6。

2.2 形態學特征

2.2.1 菌落形態。PDA培養基上，25 ℃培養7 d，菌落直徑12～14 mm，白色，表面平坦，質地絲絨狀，反面黃色，無滲出液產生，無可溶性色素產生；PDA培養基上，25 ℃培養14 d，菌落直徑25～27 mm，菌絲白色，中央淺黃色，反面蛋黃色，無滲出液產生，無可溶性色素產生（圖2A～D）。

2.2.2 顯微形態。菌絲纏繞分枝，透明無色，壁平滑，有橫隔，寬度為2.5～3.0 μm；大量菌絲頂端彎曲成菌環；菌絲老后，壁加厚，棕色；生殖菌絲變粗，頂部產生分枝，分隔明顯，縊縮斷裂產生厚壁膨大的柱狀孢子（圖2E～L）。

2.3 序列系統發育分析

將上述分離得到的6個純菌株分別提取基因組DNA，對其26S rDNA序列進行測序與系統發育分析，6個菌株聚為同一系統發育支，且與稻綠核菌（Ustilaginoidea virens）序列相似性均為100%，證明6個菌株為同一菌種，詳見系統發育樹（圖3）。選取菌株RSF6為代表，將該菌株測序序列提交至GenBank數據庫，序列登錄號為KX885488。

3 討論與結論

目前，我國雜交水稻育種水平較高，但仍存在一些問題，如部分品種抗性（抗病蟲、抗逆）弱，適應生態環境能力不強，一些超級雜交稻品種在推廣中因抗性差，導致農業生產減產，造成巨大損失[8]；從另外一個方面來看，對重點病原菌的研究可為制定和實施合理有效的預防措施提供科學的參考依據。

該研究通過微生物培養分離方法，從雜交水稻“深兩優5814”稻曲球中分離得到病原真菌，結合形態學比對和核酸序列系統發育分析方法，獲得絕對優勢病原菌種，并將其鑒定為稻綠核菌，為進一步防治該病原真菌與減少水稻稻曲病病害發生奠定了前期研究基礎。

基于該研究進展，下一步將利用多組學研究技術開展該病原真菌致病機理與生防拮抗研究，并從種子微生態學和“植物與微生物共生體育種” [9]的新視角開展雜交水稻的抗稻曲病育種與提質研究，這對于推進雜交水稻種子科學研究及種業發展具有重要的理論與實踐價值。

參考文獻

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