玉葉金花SSR—PCR體系的優化

鄭艷　胡章立　陳濤

摘要 [目的]優化玉葉金花SSR-PCR擴增反應體系。[方法]以紅紙扇為材料，采用正交設計和單因素試驗方法，從Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA濃度以及退火溫度4個方面對玉葉金花SSR-PCR體系進行優化，并采用4對SSR引物和4種玉葉金花植物樣品進行驗證。[結果]玉葉金花20 μL的 SSR-PCR反應最優體系為Mg2+濃度1.50 mmol/L、dNTPs濃度0.150 mmol/L、引物濃度0.45 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.00 U、模板DNA 15 ng、退火溫度53.4 ℃。[結論]該反應體系的擴增條帶清晰、穩定、重復性好，可用于玉葉金花的SSR分子標記開發、物種分子鑒定、遺傳多樣性分析和譜系關系構建等相關研究。

關鍵詞 玉葉金花；正交設計；SSR分子標記；PCR體系優化

中圖分類號 S188 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）13-0098-06

Optimization of SSR-PCR System for Mussaenda L.

ZHENG Yan1，2，HU Zhangli1，CHEN Tao1，2*

（1.College of Life Sciences and Oceanography，Shenzhen University，Shenzhen，Guangdong 518060；2.Shenzhen Fairy Lake Botanical Garden，CAS， Shenzhen，Guangdong 518004）

Abstract [Objective]To optimize SSR-PCR amplification reaction system for Mussaenda by orthogonal design.[Method]The orthogonal design and single factor test were adopted to optimize the SSR-PCR system using M.erythrophylla genomic DNA as template.Six factors including the concentration of Mg2+，dNTPs，Taq DNA polymerase，primer，DNA template and annealing temperature were tested separately in this system，which was further verified by four primers and samples of four Mussaenda species.[Result]The optimized SSR-PCR reaction system condition was obtained in a 20 μL system containing 1.50 mmol/L Mg2+，0.150 mmol/L dNTPs，0.45 μmol/L SSR primer，2.00 U Taq DNA polymerase and 15 ng DNA template，and the annealing temperature 53.4 ℃.[Conclusion]With clear，stable and reproducible bands，the system can be used for SSR maker development，germplasm identification，genetic diversity and relationship analyses.

Key words Mussaenda L.；Orthogonal design；SSR molecular marker；PCR system optimization

玉葉金花屬（Mussaenda L.）植物屬于茜草科（Rubiaceae）金雞納亞科（Cinchonoideae）玉葉金花族（Mussaendeae），主要分布于非洲、亞洲及西南太平洋島嶼，全世界有130多種，我國玉葉金花屬植物約有28種，主產于西南部至東南部以及西藏和臺灣[1-3]。玉葉金花屬植物一般為纏繞藤本、灌木和小喬木，主要特征是具有擴大的花瓣狀萼葉，不開裂漿果，具有較高的觀賞價值[4]。部分玉葉金花屬植物全株可入藥，有清熱解毒、去濕、止渴、活血化瘀等功效，也可作為涼茶配料，預防感冒等，有的種類提取物還具有抗菌和抗癌等功效[5-6]，因此玉葉金花具有重要的開發利用價值。

簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）在真核和原核生物基因組中分布廣泛。SSR分子標記具有共顯性、多態性高、易檢測、操作簡單等優點，在植物的親緣關系鑒定、遺

傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構建、分子標記輔助育種等方

面應用廣泛[7-10]。目前，基于SSR標記技術的玉葉金花屬植物的研究較少，結果不夠理想[11-13]。筆者采用正交試驗設計和單因素試驗相結合，對SSR-PCR反應體系中的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA的濃度以及退火溫度進行優化，以期為后續玉葉金花SSR分子標記的全面開發、遺傳多樣性分析和分子分類鑒定等相關研究提供參考和應用。

1 材料與方法

1.1 材料

以紅紙扇、大葉玉葉金花、廣東玉葉金花、墨脫玉葉金花為材料，材料采自廣東省深圳市仙湖植物園玉葉金花保育與研發基地。采集幼嫩健康的葉片用硅膠進行干燥處理，其中紅紙扇用于SSR-PCR體系優化試驗，驗證試驗采用4種樣品（表1）。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑。DL2000 DNA Marker、PCR擴增所用的10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs和Taq DNA聚合酶均購于寶生物工程（大連）有限公司。 試驗所用的SSR引物由賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成，其中引物M8用于正交試驗及單因素試驗，引物M2、M10和M11用于體系驗證試驗（表2）。

1.2.2 主要儀器。NanoDrop 2000超微量分光光度計、BIO-RAD T100TM Thermal Cycler、DYCP-31DN水平電泳儀購于北京六一儀器廠、BIO-RAD全自動凝膠成像系統。

1.3 方法

1.3.1 玉葉金花基因組DNA提取。采用CTAB法提取玉葉金花基因組DNA[14]，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測DNA濃度，并用TE buffer稀釋至50 ng/L備用。

安徽農業科學 2018年

1.3.2 正交試驗設計。采用L16（45）正交設計，對玉葉金花SSR-PCR體系中的Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA用量進行5因素4水平的優化試驗。SSR-PCR總反應體系為20 μL，除上述5個變化因素外，每個體系還包含2 μL 10×PCR buffer，其他用ddH2O補齊，每個處理重復3次（表3、4）。

1.3.3 單因素試驗設計。

利用正交試驗設計中16組試驗的結果，選出1組結果最佳的濃度組合，以此為基準進行PCR體系單因素試驗，進一步優化SSR-PCR體系。每個因素設置8個水平，每個處理重復3次（表5）。

1.3.4 SSR-PCR擴增及檢測。PCR反應在BIO-RAD T100TM Thermal Cycler上進行，采用Touchdown PCR擴增程序[15]：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，7個循環且每個循環降低1 ℃；之后94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應的結果用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，以DL2000 DNA Marker作為對照，采用BIO-RAD全自動凝膠成像系統觀察并拍照。

1.3.5 退火溫度的優化。選用以上試驗所得最佳反應體系，對SSR引物退火溫度進行篩選。設置退火溫度為48～65 ℃，用BIO-RAD T100TM Thermal Cycler自動生成8個退火溫度：48.0、49.0、50.7、53.4、56.5、59.1、60.9、62.0 ℃。

1.3.6 反應體系驗證。通過正交試驗和單因素試驗篩選出玉葉金花SSR-PCR最佳反應體系以及最佳退火溫度，使用4對引物M2、M8、M10和M11對4個不同種的玉葉金花樣品進行PCR擴增，重復2次，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以驗證反應體系的可靠性和穩定性。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果 用CTAB法提取的玉葉金花基因組DNA OD260/OD280為1.81～1.91，濃度為105～243 ng/μL，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰，說明DNA完整性好，可用于SSR-PCR試驗（圖1）。

2.2 正交試驗結果分析

由圖2可知，L16（45）正交設計的16個處理3次重復的結果，因Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物及DNA濃度的不同組合，擴增效果出現了明顯差異。第2、3、4、5、6、11、12、14、16組條帶模糊，出現彌散現象，且結果不穩定；第1和13組擴增結果較穩定，但條帶不清晰；第7、8、9和15組擴增條帶明亮，較清晰；第10組條帶最明亮、清晰，條帶大小與理論值相符，無引物二聚體，且重復性好，亮度一致。

根據對各組合擴增結果的比較分析，第10組的各種因素組合為最佳選擇，即20 μL反應體系中含2.00 mmol/L Mg2+、0.150 mmol/L dNTPs、2.00 U Taq DNA聚合酶、0.50 μmol/L 引物及20 ng DNA。

2.3 單因素試驗結果分析

以SSR-PCR正交試驗結果最好的第10組為基準，對Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA這5個因素進行單因素試驗，圖3為1次試驗的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果。

2.3.1 Mg2+濃度對SSR-PCR反應的影響。

Mg2+通過調控Taq DNA聚合酶的活性影響PCR反應。由圖3可知，隨著Mg2+濃度的升高，PCR產物條帶的亮度呈先升高后降低的趨勢，說明Mg2+濃度過低或過高都會影響PCR擴增效率。第3組即Mg2+濃度為1.50 mmol/L時，條帶最為明亮，因此Mg2+最佳濃度選用1.50 mmol/L。

2.3.2 dNTPs濃度對SSR-PCR反應的影響。dNTPs是PCR反應的底物，該試驗中dNTPs的濃度不同時，PCR擴增結果相當，影響不大，因此選擇正交試驗結果中的最佳濃度0.150 mmol/L。

2.3.3 Taq DNA聚合酶濃度對SSR- PCR反應的影響。Taq DNA 聚合酶濃度低時，擴增產物濃度低，結果不理想，隨著濃度的增加，擴增的條帶亮度上升。由圖3可知，當Taq DNA聚合酶的量低于1.00 U時，條帶很淡，高于1.00 U時擴增效果較好，當Taq DNA聚合酶為2.00 U時，條帶最為清晰，擴增效果最好，因此最佳選擇是2.00 U。

2.3.4 引物濃度對SSR-PCR反應的影響。。

SSR引物濃度對PCR結果的影響不是很大，其中第4、5、6、7和8組條帶清晰，擴增效果均很好，第1、2、3組相對較差，即引物濃度為045～0.65 μmol/L時，PCR結果很好，濃度為0.30～0.40 μmol/L時擴增結果稍差。引物濃度過高時，容易產生非特異性擴增及引物二聚體，綜合考慮到成本，選擇濃度較低的第4組，即引物濃度的最佳選擇為0.45 μmol/L。

2.3.5 模板DNA濃度對SSR-PCR反應的影響。由圖3可知，DNA模板對PCR擴增的影響較大，隨著DNA濃度的增高，條帶逐漸變淡，最低濃度15 ng為最佳選擇。

2.4 退火溫度篩選結果分析

在PCR反應中，退火溫度影響引物與模板的特異性結合。由圖4可知，在8個不同退火溫度下，均能擴增出目的條帶。在退火溫度為48.0、49.0、50.7、53.4 ℃時，擴增結果條帶明亮，清晰；當退火溫度高于53.4 ℃時，條帶亮度較弱。因此在48.0～53.4 ℃內，擴增效果較好。退火溫度過高會影響PCR擴增的效率，而退火溫度較低時，容易出現引物二聚體，所以選擇53.4 ℃為最佳退火溫度。

2.5 體系驗證試驗結果分析

應用SSR-PCR正交試驗和單因素試驗結果所得到的最佳反應體系，選用4對SSR引物M2、M8、M10和M11對4種玉葉金花樣品進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，擴增條帶清晰、明亮，與預期產物大小相符，無引物二聚體，試驗結果穩定，重復性好（圖5）。

綜上所述，玉葉金花SSR-PCR的20 μL最佳反應體系為1.50 mmol/L Mg2+、0.150 mmol/L dNTPs、0.45 μmol/L引物、2.00 U Taq DNA聚合酶、15 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer，其他用ddH2O補齊，最佳退火溫度為53.4 ℃。

3 討論

SSR標記作為一種重要的分子標記，在物種的遺傳多樣性分析、種群遺傳結構分析、物種系統進化關系分析、遺傳圖譜構建、品種鑒定和分子標記輔助育種等方面具有廣泛的應用[9，16]。SSR-PCR反應的擴增效果受諸多因素影響，探索玉葉金花SSR的最佳PCR反應體系，對SSR分子標記在玉葉金花屬植物研究中的應用十分關鍵。

該研究采用正交設計和單因素試驗相結合的方法對玉葉金花SSR-PCR反應體系進行優化，其中正交試驗能夠均衡各個試驗因素，綜合各因素之間的交互作用，以便快速找出最佳的組合。在正交試驗的基礎上，結合單因素試驗設計，充分考慮到各因素的影響，提高了試驗結果的準確性[17-19]。

SSR-PCR反應體系中，各因素交互影響。Mg2+能夠影響Taq DNA聚合酶的活性，還會與dNTPs結合，產生拮抗作用[20]。dNTPs濃度過高，容易產生引物二聚體和非特異性擴增，還會與Mg2+結合導致Taq DNA聚合酶的活性降低。Taq DNA聚合酶濃度過低會導致活性不夠，反應不充分；濃度過高不僅浪費原料，還會降低反應的特異性。引物的特異性及穩定性會影響擴增產率，引物濃度過低會導致產量下降或擴增失敗，濃度過高則容易引起堿基錯配，形成引物二聚體[21-22]。

在繡球[18]、紅椿[23]、綠豆[24]等植物的研究中發現Mg2+濃度對SSR-PCR反應的影響最大。該研究中，PCR的效果隨著Mg2+濃度的上升呈現先上升后下降的趨勢，這與眾多研究結果類似，但是Mg2+濃度的變化并未導致擴增失敗，可能是由于該研究所設計的濃度梯度變化不大。在大多數研究中，PCR反應對DNA模板的量要求很寬泛，認為模板DNA對反應影響最小[19，24]。該研究結果顯示，隨著DNA模板濃度的提高，PCR反應效果明顯下降。這可能是由于玉葉金花材料中多糖等其他成分的含量較高，而該試驗采用的CTAB法提取基因組DNA，未能將雜質去除干凈，瓊脂糖電泳檢測結果顯示模板DNA主帶明顯，但濃度不高，含有雜質。在DNA濃度高的同時，因雜質含量較高，從而影響了PCR反應結果。PCR試驗對模板DNA含量要求不高，因此僅15 ng便能滿足試驗要求，并且效果很好。然而，玉葉金花模板DNA的提取及純化方法還需要改進。退火溫度影響PCR反應中引物與模板的特異性結合。退火溫度過高會影響PCR擴增的效率；退火溫度過低時，容易發生錯配，出現引物二聚體，該試驗篩選出53.4 ℃為最佳退火溫度。

該研究通過正交試驗設計，結合單因素試驗，建立了玉葉金花SSR-PCR反應的最優反應體系：1.50 mmol/L Mg2+、0.150 mmol/L dNTPs、0.45 μmol/L引物、2.00 U Taq DNA聚合酶、15 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer，用ddH2O補齊至20 μL，最佳退火溫度53.4 ℃。此反應體系可用于玉葉金花屬植物的SSR引物開發、物種分類鑒定、遺傳多樣性和種群遺傳結構分析等方面的研究。

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