高通量測序技術研究魚腥草酵素對小鼠腸道菌群的影響

趙菲 劉孝余 宮芳婧等

摘要 [目的]采用高通量測序技術分析魚腥草酵素對昆明雄性小鼠腸道菌群的影響。[方法]連續灌胃20 d后，收集小鼠糞便，采用高通量測序技術對各組小鼠糞便菌群進行分析。[結果]魚腥草酵素組（C）小鼠腸道菌群物種多樣性最高，生理鹽水組最低；另外，小鼠腸道中有益菌與致病菌比例在各組之間差異顯著，魚腥草酵素組中有益菌群的比例均大于生理鹽水組和水果酵素組，而致病菌比例最高的為水果酵素組（56.36 %）。[結論]魚腥草酵素對小鼠的腸道菌群具有調節作用。

關鍵詞 魚腥草酵素；小鼠；腸道菌群；高通量測序

中圖分類號 R151 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）32-0156-04

Effect of Houttuynia cordata Enzyme on Intestinal Flora in Mice Evaluated by Highthroughput Sequencing

ZHAO Fei，LIU Xiaoyu，GONG Fangjing et al （College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023 ）

Abstract [Objective]Highthroughput sequencing technology was used to analyze the effect of Houttuynia cordata enzyme on intestinal microflora in Kunming male mice.[Method]Thirty mice were randomly divided into three groups：saline group （B），fruit enzyme group （S），and Houttuynia cordata enzyme group （C）.After 20 days of continuous gavage，the feces of the mice were collected and the fecal microbiota of each group were analyzed by highthroughput sequencing.[Result]The results showed that the species diversity of the intestinal flora in the Houttuynia cordata enzyme group （C） was the highest，and that of the saline group was the lowest.In addition，the ratio of beneficial bacteria and pathogenic bacteria in the intestinal tract of the mice varied significantly among the groups.The proportion of beneficial bacteria in the grass enzyme group was greater than that in the saline group and the fruit enzyme group，and the highest proportion of pathogenic bacteria was in the fruit enzyme group （56.36 %）.[Conclusion]Houttuynia cordata enzyme modulates the intestinal flora of mice.

Key words Houttuynia cordata enzyme；Mice；Intestinal flora；Highthroughput sequencing

作者簡介 趙菲（1985—），女，山東鄒平人，博士，講師，從事食品營養研究。*通訊作者，博士，教授，從事食品科學研究。

收稿日期 2018-06-25；修回日期 2018-09-21

魚腥草是三白草科蕺菜屬植物蕺菜（Houttuynia cordata Thunb）的全草，《本草綱目》載：“其葉腥味，故俗稱魚腥草”。其別名多因地而異，如側耳根、雞兒根、臭靈丹、臭蕎麥等[1]。魚腥草還含有大量的對身體有益的活性物質，如魚腥草素、多糖、黃酮類化合物等[2-3]。魚腥草具有清熱排毒、利尿通淋等功能[4]，已被國家衛生健康委員會（原衛生部）正式確定為“既是藥品，又是食品”的資源之一，現已受到越來越多的關注。魚腥草酵素和水果酵素均為益生菌發酵后的產品[5-6]。益生菌發酵對腸道菌群的多樣性具有顯著影響，在其他研究領域已經被系統論證，而有關魚腥草酵素和水果酵素對腸道菌群的影響目前尚不清楚。

腸道中微生物的生長繁殖和變化與糞便中菌群的組成關系密切，因此，通過對糞便中菌群多樣性構成的研究可以有助于人們了解腸道菌群的變化規律[7]。近些年來，在微生物菌群分析中，更多的是采用分子生物學技術進行菌落分析，相對而言，高通量測序技術對于腸道菌群的組成分析具有準確定量、定時檢測的優勢。通過高通量測序技術的應用，有助于對腸道菌群組成進行較全面的研究[8-9]。

筆者通過研究生理鹽水（B）、水果酵素（S）、魚腥草酵素（C）灌胃小鼠后，對小鼠腸道菌群進行高通量測序，探討魚腥草酵素對小鼠腸道菌群微生物多樣性的影響，即采用高通量測序技術對小鼠糞便菌群16S rRNA 的V4 區域進行測序，再與silva數據庫中的基因序列進行比對，得到樣品中所含有的微生物種類及豐度；分析魚腥草酵素（C）灌胃的小鼠糞便菌群的結構及多樣性，再與生理鹽水（B）和水果酵素（S）灌胃小鼠的糞便菌群進行比較，以全面了解魚腥草酵素對小鼠腸道菌群的影響，旨在為人類健康飲食提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明小鼠，30只，雄性（20±2）g，采購于大連醫科大學動物實驗中心。實驗小鼠飼養于遮光室內的鼠籠中，室溫（25±3） ℃，相對濕度40%～60%，自由飲水和取食。小鼠飼料購置于大連醫科大學動物實驗中心。實驗動物許可證號 SYXK（遼）2008-0002。

1.2 方法

1.2.1 魚腥草酵素的制作。將蘋果、梨、木瓜、胡蘿卜、山藥、冬瓜、辣椒、大白菜、蘿卜、桔梗洗凈并瀝干，切成1～3 cm見方的塊狀；將大棗、藍莓、黑果花楸、黑加侖、山葡萄、木耳、枸杞子及沙棘洗凈并瀝干；各取相同質量進行混合，得混合物A；將混合物A與食醋、紅糖、魚腥草按質量比15.0∶1.0∶0.5∶0.5進行混合，得混合物B，再將燒酒曲、酵母、乳酸菌及醋酸菌加入混合物B中，于發酵罐中10～25 ℃發酵50 d，得一次發酵液；所述燒酒曲、酵母、乳酸菌及醋酸菌的加入量為混合物B質量的0.5%～1.0%、1.0%～2.5%、1.0%～1.5%、1.0%～1.5%，所述燒酒曲、酵母、乳酸菌及醋酸菌的菌數為（15～26）×106個/ml。將一次發酵液置于發酵罐中，所述一次發酵液體積為發酵罐容積的2/3，發酵罐保持36～38 ℃恒溫發酵至少60 d，發酵的同時于發酵罐底向發酵罐內通入空氣，1 m3發酵罐空氣通入量為0.5～1.0 L/min，即得魚腥草發酵液；將所得魚腥草發酵液過濾，濾液放入罐中浸泡竹炭貯藏30 d，即得魚腥草酵素。

1.2.2 小鼠糞便的收集。

將30只昆明小鼠隨機分成3組，每天9：00～11：00分別采用生理鹽水（B）、魚腥草酵素（C）、水果酵素（S）對各組進行灌胃，灌胃量為0.2 mL/10 g，連續20 d。最后一次灌胃24 h后，采用拎尾法收集各組糞便于干燥無菌的離心管中，后立即放于液氮中速凍。

1.2.3 DNA的提取及測序。

將速凍的小鼠糞便采用干冰送樣方法寄送至深圳華大基因科技服務有限公司武漢分公司，針對樣品16S rRNA基因V4區采用V4通用引物進行PCR擴增及測序。采用窗口去質量的方法去除接頭污染reads、含N的reads、低復雜大的reads，樣品通過barcode合并建庫后，采用barcode將樣品拆分后，對樣品物種組成和豐度進行分析，即OTU及其豐度分析（OTU聚類、OTU韋恩、OTU PCA分析、OTU Rank曲線）、物種及其豐度分析；樣品復雜度分析，即單個樣品復雜度（Alpha多樣性、Alpha多樣性稀釋曲線圖、Alpha多樣性合性圖）、樣品間復雜度比較分析（Beta分析等）、樣品組間顯著性差異因子、LEFSe組間群落差異分析；16S測序樣品功能預測和差異性分析。

2 結果與分析

2.1 菌群多樣性

利用Mothur軟件對每個樣品的OTU數量（相似水平97%以上）進行計算，OTU數量可以代表樣品物種的豐度[10]。由表1可知，在所有樣品中，樣品OTU數量最多的為魚腥草酵素C3組（446），最少的為生理鹽水B3組（389），這表明小鼠糞便中菌群豐度存在差異。其中，樣品中菌群多樣性指數最高的為魚腥草酵素C2組（ACE值472.003 6 和Chao值471.794 1最高），最低的為生理鹽水B3組（ACE值408.633 0和Chao值406.531 3最低）。同時，Alpha多樣性分析也表明，給小鼠灌胃魚腥草酵素后，其腸道菌群的多樣性高于水果酵素組和生理鹽水對照組，且魚腥草酵素組的糞便菌群豐度最高。Shannon指數越大，表示群落多樣性越高，9組樣品中以魚腥草酵素組C3的Shannon值最大（4.612 270），水果酵素組S2次之。Simpson值越低表示群落多樣性越高，魚腥草酵素組C3的Simpson值在9組樣品中最?。?.019 000），其次為水果酵素組S2的Simpson值，為0.026 708。Coverage指數是樣品的測序深度也表明樣品的覆蓋率，9個樣品的Coverage指數均在0.89以上，表明樣品中序列未被檢測到的可能性較低。各組樣品糞便菌群的OTU數量及Alpha多樣性說明，3個魚腥草酵素組小鼠糞便的菌群多樣性最高，魚腥草酵素對小鼠的腸道菌群具有一定的調整作用，且作用效果最為突出。

2.2 菌群構成

通過與數據庫進行比對，對OTU進行物種分類并分別在門、綱、目、科、屬幾個分類等級上對各個樣品作柱狀圖分析。

由圖1可見，腸道微生物種類繁多，健康的腸道中微生物從門的水平上可分為6大類：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia） ，其中90%以上由厚壁菌門和擬桿菌門構成[11]。從該試驗的糞便微生物群落結構上看，魚腥草酵素組（C）和水果酵素組（S）小鼠的糞便菌群與生理鹽水組（B）有顯著差異。在門的水平上，擬桿菌門（Bacteroidetes）在魚腥草酵素組（C）小鼠糞便菌群中的相對比例最高（63.86%），在水果酵素組（53.20%）、生理鹽水組（39.64%）中擬桿菌門在小鼠糞便菌群中的相對比例均低于魚腥草酵素組。小鼠腸道中的擬桿菌門（Bacteroidetes）主要為擬桿菌綱（Bacteroidia），擬桿菌門（Bacteroidetes）是腸道內第二大優勢類群，參與腸道內糖類、脂類的代謝，對宿主健康有很重要的影響，魚腥草酵素組的擬桿菌門（Bacteroidetes）的顯著增加，提示腸道中物質代謝存在一定程度的優化；厚壁菌門（Firmicutes）在魚腥草酵素組（C）中的相對比例達到28.31%，與其他2組差異不顯著。厚壁菌門（Firmicutes）在腸道中能夠幫助多糖發酵，厚壁菌門包括芽孢桿菌綱（芽孢桿菌目和乳桿菌目），其中芽孢桿菌屬的主要作用是維持動物腸道的健康[12]。該試驗中小鼠糞便中的第二大優勢菌就是厚壁菌門（Firmicutes），表明魚腥草酵素能夠參與糖類代謝，保持腸道菌群健康。而變形菌門（Proteobacteria）在魚腥草酵素組（5.40%）小鼠糞便菌群中占比最低，其他2組中變形菌門的比例高于魚腥草酵素組。變形菌門（Proteobacteria）是細菌中最大的一門，包括大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺旋桿菌等病原菌，這類細菌易引起動物腹瀉[13]。該研究中魚腥草酵素組變形菌門的大量減少，提示腸道中存在的炎癥狀態有所改善。

由圖2可見，在綱的水平上，生理鹽水組中梭菌綱（Clostridia）、幽門螺桿菌綱（Epsilonproteobacteria）、脫鐵桿菌綱（Deferribacteres）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、δ變形菌綱（Deltaproteobacteria）的相對豐度比例最高，魚腥草酵素組比例最低。試驗結果表明，魚腥草酵素明顯降低了小鼠腸道內致病菌的含量，改善了腸道菌群，而擬桿菌綱（Bacteroidia）的比例在生理鹽水組最低，魚腥草酵素組中擬桿菌綱（Bacteroidia）比例最高，表明擬桿菌綱作為第一優勢菌參與腸道內糖類、脂類的代謝，魚腥草酵素有效地改善了小鼠腸道的菌群組成。

由圖3可見，在目的水平上，生理鹽水組中梭菌目（Clostridiales）、彎曲桿菌目（Campylobacterales）、乳桿菌目（Lactobacillales）、脫鐵桿菌目（Deferribacterales）、脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）的比例最高，魚腥草酵素組中比例最低，且水果酵素和魚腥草酵素組中彎曲桿菌目（Campylobacterales）、乳桿菌目（Lactobacillales）和脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）比例下降明顯，表明酵素組能夠選擇性地抑制有害菌的生長，并使腸道菌群的比例得到優化，其中，以魚腥草酵素效果尤為明顯。而擬桿菌目（Bacteroidales）在生理鹽水組中比例最低，在魚腥草酵素組中比例最高，擬桿菌目（Bacteroidales）在魚腥草酵素組小鼠腸道中比例增加，表明魚腥草酵素能有效改善腸道菌群組成，使有益菌含量增加顯著。

如圖4所示，在科的水平上，生理鹽水組（B）、水果酵素組（S）和魚腥草酵素組（C）中物種組成相似度較高，其中擬桿菌科S24_7、幽門螺桿菌科（Helicobacteraceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）豐度差距較大，且在生理鹽水組中豐度最高，魚腥草酵素中豐度最低且呈下降趨勢。試驗結果表明，腸道微生物菌群中桿菌出現下降趨勢，而其他腸道共生菌則呈現上升趨勢，表明水果酵素和魚腥草酵素均能改善腸道菌群組成，降低有害菌比例，且以魚腥草酵素效果顯著。除此之外，在水果酵素組和魚腥草酵素組檢測出產堿桿菌科（Alcaligenaceae）、類桿菌科（Bacteroidaceae）、脫鐵桿菌科（Deferribacteraceae）、韋榮球菌科（Veillonellaceae），而生理鹽水組中并未檢出上述菌科，且在魚腥草酵素組中上述菌科豐度均低于水果酵素組，呈下降趨勢。試驗結果表明，酵素灌胃組增加了腸道菌群的多樣性，而上述菌群均為致病菌，魚腥草酵素組中上述致病菌含量減低，表明魚腥草酵素安全性更高，其中，少量韋榮球菌屬對人體有益無害，不僅能夠增強人呼吸系統與消化系統的免疫力，還能將一種與牙齒相接觸的酸性物質變為弱酸性[14]。此外，在生理鹽水組和水果酵素組檢測出的Odoribacteraceae科，在魚腥草酵素組中并未檢出，這也表明魚腥草酵素確實改善了小鼠腸道菌群的組成，且效果明顯。

由圖5所示，從屬的水平上看，占比最高的是螺桿菌屬（Helicobacter），生理鹽水組（B）中螺桿菌屬（Helicobacter）豐度最高，達到15.48%，魚腥草酵素組中螺桿菌屬（Helicobacter）豐度最低，為2.55%，下降比例明顯，螺桿菌屬為已經明確的致病菌，魚腥草酵素組中螺桿菌屬豐度降低，表明魚腥草酵素能夠抑制致病菌的生長繁殖。第二大占比最高的菌是普氏菌屬（Prevotella），在魚腥草酵素中豐度最高（18.35%），在水果酵素中豐度最低（10.59%），而生理鹽水組居中（14.16%），普氏菌屬在腸道菌群中的變化，表明魚腥草酵素的灌胃使小鼠腸道菌群中有益菌的含量得到改善，成為第二大優勢菌。乳酸菌屬、Mucispirillum屬、顫螺菌屬（Oscillospira）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）在魚腥草酵素組中豐度最低，在生理鹽水組中豐度最高，表明魚腥草酵素能有效抑制有害菌的生長，除此之外，在生理鹽水組中檢測出Dorea屬，而水果酵素和魚腥草酵素組中并未檢測出；在水果酵素組中檢測出脫硫弧菌（Desulfovibrio），而生理鹽水組和魚腥草酵素組并未檢測出；在魚腥草酵素組和水果酵素組均檢測出考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）和薩特氏菌屬（Sutterella），且在水果酵素組中考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）和薩特氏菌屬（Sutterella）豐度比魚腥草酵素組高，而生理鹽水組中并未檢測出該菌屬。試驗結果表明，水果酵素和魚腥草酵素均改變了小鼠腸道菌群的組成，豐富了腸道菌群，以魚腥草酵素效果顯著。

2.3 樣品進化樹

根據已知的參考數據庫中的親緣關系，利用LEfSe軟件對得到的OTUs 構建進化樹，見圖6。

由圖6可見，在魚腥草酵素組（C）中，可以看到S24_7（擬桿菌科）、擬桿菌綱（Bacteroidia）和擬桿菌門（bacteroidia）在酵素中起重要作用，且豐度較高。從水果酵素組（S）中可以看到，韋榮球菌科（Veillonellaceae）、產堿桿菌科（Alcaligenaceae）、伯克氏菌目（Burkholderiales）作用明顯，其中伯克氏菌目（Burkholderiales）為β-變形菌綱的一個目。在生理鹽水灌胃組（B組）中可以看出，幽門螺桿菌（Helicobacteraceae）、彎曲桿菌目（Campylobacterales）、變形菌綱（Beltaproteobacteria）在腸道中起主要作用。從樣品聚類樹可以看出，不同灌胃組小鼠腸道菌群中起主要作用的微生物菌群不同，在魚腥草酵素組中擬桿菌門是其主要作用菌群，且為優勢菌群，對調節腸道菌群組成起到重要作用。而水果酵素灌胃組的腸道菌群中以變形菌門等細菌為主要作用菌群，也說明水果酵素沒有改善腸道菌群組成。在生理鹽水灌胃組中可以看出，彎曲桿菌和幽門螺桿菌及變形菌這些有害菌在腸道中起到主要作用，綜上所述，魚腥草酵素能夠顯著改善小鼠腸道菌群組成，抑制有害菌生長，并有益于優勢腸道菌群的繁殖。

3 結論與討論

腸道菌群是人體重要組成部分，腸道菌群失衡會引起人體相關功能紊亂，如可以提高急慢性疾病的發病率[15]。該研究所采用的高通量測序技術是目前應用于腸道微生物研究的前沿技術，也是一種新型測序技術[16]。糞便菌群的變化能夠明確反映出腸道菌群的健康狀態，筆者通過Illumina高通量測序技術研究生理鹽水灌胃組（B）、水果酵素組（S）、魚腥草酵素組（C）對小鼠糞便菌群多樣性的影響，分析其糞便菌群變化，結果顯示不同灌胃組小鼠腸道菌群豐度存在較大差異，且不同菌群的變化具有一定的規律性[17-18]。

在門的水平上分析，魚腥草酵素可以有效增加擬桿菌門（Bacteroidetes）的含量，減少腸道中的變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres） 的含量。在目的水平上分析，魚腥草酵素可以有效提升擬桿菌目（Bacteroidales）的含量，減少腸道中彎曲桿菌目（Campylobacterales）和乳桿菌目（Lactobacillales）、脫鐵桿菌目（Deferribacterales）、脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）的含量，且效果顯著。在綱的水平上分析，魚腥草酵素可以提升擬桿菌綱

（Bacteroidia）的含量，減少腸道中的梭菌綱（Epsilonproteobacteria）、幽門螺桿菌綱（Epsilonproteobacteria）、脫鐵桿菌綱（Deferribacteres）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、δ變形菌綱（Deltaproteobacteria）的含量。在屬的水平上分析，魚腥草酵素可以有效減少擬桿菌屬（Bacteroides）、螺桿菌屬（Helicobacter）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、Mucispirillum屬、顫螺菌屬（Oscillospira）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）的含量，增加普氏菌屬（Prevotella）的含量，且效果都比水果酵素好。

糞便菌群多樣性分析表明，魚腥草酵素組（C）小鼠糞便菌群多樣性最高，生理鹽水灌胃組（B）最低，水果酵素組（S）居中。說明魚腥草酵素的使用調整了小鼠腸道微生態的動態平衡，增加了菌群的數量。根據試驗中各組小鼠腸道中菌群含量變化的差異可知，魚腥草酵素組能夠提高小鼠腸道菌群的豐度，在一定程度上可促進有益菌群數量的增加，并抑制致病菌的繁殖。因此，攝入適量的魚腥草酵素對調節腸道菌群的平衡具有一定的幫助。

參考文獻

[1]

陳慶華，鄒秀麗，李蕓瑛，等.魚腥草營養成分的分析[J].浙江農業科學，2009（5）：992-993.

[2] 劉敏，蔣躍平，劉韶.魚腥草中生物堿類化學成分及其生物活性研究進展[J].天然產物研究與開發，2018，30（1）：141-145，133.

[3] 蔡文國，吳衛，代沙，等.不同種質魚腥草總酚、黃酮含量及其抗氧化活性[J].食品科學，2013，34（7）：42-46.

[4] 馬新方，李勇.魚腥草多糖體內抗氧化活性研究[J].中醫研究，2011，24（2）：19-20.

[5] 劉加友，王振斌.微生物酵素食品研究進展[J].食品與發酵工業，2016，42（1）：273-276.

[6] 趙芳芳，莫雅雯，蔣增良，等.功能性微生物酵素產品的研究進展[J].食品與發酵工業，2016，42（7）：283-287.

[7] KABIR M A，FUJITA T，OUHARA K，et al.Houttuynia cordata suppresses the Aggregatibacter actinomycetemcomitansinduced increase of inflammatoryrelated genes in culture human gingival epithelial cells[J].Journal of dental sciences，2015，10：88-94.

[8] ZHOU N N，TANG J，CHEN W D，et al.Houttuyninum，anactive constituent of Chinese herbal medicine，inhibits phosphorylation of HER2/receptor tyrosine kinase and the tumor growth of HER2/neuoverexpressingcancer cells[J].Life sciences，2012，90（19/20）：770-775.

[9] 王麗鳳.益生菌L.plantarum P-8對肉雞腸道菌群、腸道免疫和生長性能影響的研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2014：2-10.

[10] LI R Q，ZHU H M，RUAN J，et al.De novo assembly of human genomes with massively parallel short read sequencing[J].Genome research，2010，20（2）：265-272.

[11] YANG F，ZENG X W，NING K，et al.Saliva microbiomes distinguish caries-active from healthy human populations[J].The ISME Journal，2012，6（1）：1-10.

[12] ZHANG M L，ZHANG M H，ZHANG C H，et al.Pattern extraction of structural responses of gut microbiota to rotavirus infection via multivariate statistical analysis of clone library data[J].FEMS Microbiology Ecology，2009，70（2）：21-29.

[13] 李曉敏，楊麗杰，霍貴成.Illumina技術研究不同喂養方式嬰兒腸道菌群差異[J].食品科技，2012，37（9）：319-324.

[14] ECKBURG P B，BIK E M，BERNSTEIN C N，et al.Divers it of the human intestinal microbial flora [J].Science，2005，308（5728）：1635-1638.

[15] LOZUPONE C A，STOMBAUGH J I，GORDON J I，et al.Diversity，stability and resilience of the human gur microbiota[J].Nature，2012，489（7415）：220-230.

[16] MARIAT D，FIRMESSE O，LEVENEZ F，et al.The Firmicutes/Bacteroidetes ratio of the human microbiota changes with age [J].BMC Microbiol，2009，9（1）：123.

[17] LARSBRINK J，ROGERS T E，HEMSWORTH G R，et al.A discrete genetic locus confers xyloglucan metabolism in select human gut Bacteroidetes[J].Nature，2014，506（7489）：498-502.

[18] HAAS B J，GEVERS D，EARL A M，et al.Chimeric 16S rRNA sequence formation and detection in Sanger and 454-pyrosequenced PCR amplicons[J].Genome research，2011，21（3）：494-504.