纖維素酶嵌合體EGX—Gluc1C的構建與表達

陳玲玲 徐進平

摘要 [目的]設計和構建一種由β-糖苷水解酶Gluc1C和多功能纖維素酶EGX融合而成的纖維素酶嵌合體EGX-Gluc1C。[方法]首先構建了嵌合體的質粒，采用GST標準純化方法，分別獲得重組蛋白Gluc1C、EGX、纖維素酶嵌合體EGX-Gluc1C，并且制備了抗Gluc1C的血清。[結果]通過GST純化的3個蛋白純度達90%，可以進行后續的酶活檢測；通過Western blot驗證，發現抗Gluc1C的血清效價很高（稀釋比例達1∶5 000）。[結論]該研究可為纖維素酶的工業化應用提供一定理論依據。

關鍵詞 纖維素酶；EGX；Gluc1C；抗體；纖維素酶嵌合體

中圖分類號 S188文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）01-0102-03

Abstract [Objective]To design and construct chimera cellulase EGX-Gluc1C originated from the fusion of β-glucosidase Gluc1C and a cullulase EGX. [Method]First， we generated the plasmid inserting chimera cellulase. Then， we purified the recombinant Gluc1C， EGX and EGX-Gluc1C according to the standard GST purification manual. We also generated the anti-Gluc1C serum from the rabbit. [Result]The coomassie staining results demonstrated that the purity of these proteins was 90%， which was sufficient for enzyme catalytic assay. Through verification of western blot，the anti-Gluc1C serum produced from rabbit was of high quality and the dilution ratio can be 1∶5 000. [Conclusion]The study provided a theoretical basis for the industrial application of cellulase.

Key words Cellulase；EGX；Gluc1C；Antibody；Chimera cellulase

纖維素是陸地環境中最主要的光合作用產物，也是地球上最豐富的可再生生物資源，每年纖維素的產量為1 000億t左右。纖維素降解無論是在農業生產還是廢物處理的過程中，都顯得十分重要，因為纖維素處理好就能夠得到大量可再生生物資源，處理不好將成為難以降解的生物垃圾[1-3]。纖維素降解需要多種纖維素酶協同作用，如果能夠使用一個表達系統同時表達純化2種甚至多種纖維素酶，則可以降低工業生產中酶的經濟投入[4-5]。EGX是從福壽螺中分離得到的一種多功能纖維素酶，Gluc1C是從棉鈴蟲腸道菌中分離得到的一種高效的β-糖苷水解酶，由448個氨基酸組成，包含糖苷水解酶GH superfamily 1結構域[6]。筆者將EGX和Gluc1C的基因構建在同一個表達質粒上，并表達出有生物活性的纖維素酶嵌合體EGX-Gluc1C，以期為纖維素酶的工業化應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒。

試驗所用的菌株包括 E.coli TOP10、 E.coli RIL （DE3），質粒pGEX-6p-1、pET22b-Gluc1C和pET32a-EGX。

1.1.2 生化試劑。DNA Taq 酶（康為公司）、KOD Plus Neo聚合酶（TOYOBO）、限制性內切酶（TOYOBO）、T4 DNA連接酶（Thermo Scientific）、膠回收試劑盒（康為公司）、PCR回收試劑盒（康為公司）、Tiangen質粒小提試劑盒、GST resin（Q-Smart公司）。

1.1.3 引物及核苷酸序列。

試驗采用的引物用DNAman軟件設計，引物合成由武漢天一輝遠公司完成，引物名稱及序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建。以實驗室已有的pET22b-Gluc1C和pET32a-EGXA作為模板構建EGX-Gluc1C嵌合體。

1.2.2 重組工程菌的制備。

將質粒pGEX-6p-1-EGX-Gluc1C轉化大腸桿菌BL 21（DE3）感受態細胞，得到的陽性克隆經PCR鑒定為陽性的菌落即為能表達嵌合體纖維素酶EGX-Gluc1C的大腸桿菌重組基因工程菌RIL pGEX-6p-1-EGX-Gluc1C。

1.2.3 重組蛋白的純化。按照標準GST樹脂結合標簽蛋白的方法純化目的蛋白。蛋白的表達和純化通過SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染色檢測。

1.2.4 Gluc1C抗體的制備。

將純化的纖維素酶嵌合體EGX-Gluc1C包涵體經過SDS-PAGE后，切割包含目的條帶的膠條，作為抗原，輔以佐劑Freunds Adjuvant Incomplete注射進入新西蘭大白兔體內，總蛋白量為2 mg，每隔14 d免疫1次，共3次，制備抗Gluc1C的免疫血清。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pGEX-6P-1-EGX-Gluc1C的構建 以實驗室已有的pET32a-EGXA作為模板，用引物4和5擴增EGX序列，然后再以這一步得到的PCR產物作為模板，用引物4和6擴增包含linker序列的EGX序列。使用酶切位點 Eco R I和 Bam H I將目的序列插入到pGEX-6P-1載體上（圖1）。接著以實驗室已有的pET22b-Gluc1C作為模板，用引物1和2擴增EGX序列，回收以后，使用酶切位點 Xho I

和 Eco R I將目的序列插入到pGEX-6P-1-EGX（含linker）載體上。圖2為嵌合體載體雙酶切鑒定結果。接著，將測序正確的3個質粒pGEX-6P-1-EGX、pGEX-6P-1-Gluc1C、pGEX-6P-1-EGX-Gluc1C轉入 E.coli RIL（DE3），獲得能夠表達3個相應蛋白的工程菌。

2.2 融合蛋白的表達與純化

表達目的蛋白的重組工程菌株RIL pGEX-6P-1-EGX的表達條件為IPTG 0.4 mmol/L，28 ℃誘導表達3 h，培養體積為1 L。根據標準的GST純化流程進行蛋白純化。從洗脫組分看，第1次洗脫的蛋白濃度最高，依次減少，獲得的蛋白較純，僅在40 kD上方有一處雜帶。通過同樣的純化方法，獲得了重組蛋白EGX，EGX-Gluc1C，并且濃縮洗脫組分，最終蛋白濃度統一為0.5 mg/mL（圖3）。

2.3 抗Gluc1C抗體的制備及效價檢測

為了能夠更深入地研究Gluc1C的功能，制備了抗Gluc1C的血清。選擇直接用目的蛋白的包涵體作為抗原，經過SDS-PAGE后，切割包含目的條帶的膠條，注射進入兔子體內。每隔7 d免疫1次，共3次，最終獲得抗Gluc1C的免疫血清，通過Western blot檢測了血清的效價。取Gluc1C和嵌合體的誘導前、誘導后蛋白樣進行檢測發現，獲得的免疫血清能夠很好地識別目的蛋白Gluc1C，并且也能識別嵌合體（圖4）。

3 討論與結論

纖維素是地球上現存分布最廣和含量最豐富的碳水化合物[7]。對人類而言，纖維素也是自然界中數量最大的可再生資源，它的降解和再利用無疑是自然界碳素循環的中心環節。纖維素酶作用于纖維素的分子機制至今沒有完全研究清楚，纖維素酶產生菌的產酶能力不足，以及所產生的纖維素酶的組分不全是導致這一領域的研究與實際應用存在一定距離的主要原因[8]。不同的微生物合成的纖維素酶不僅在組成上有顯著的差異，而且對纖維素的水解能力也大不相同，原核生物和真核生物均能產纖維素酶[9-10]。該研究構建了纖維素酶嵌合體EGX-Gluc1C ，其中EGX是從福壽螺胃液中分離得到的一種多功能纖維素酶，同時具有多種纖維素酶活性，Gluc1C是從類芽孢桿菌中分離出的一種β-糖苷水解酶。中間以甘氨酸和絲氨酸構成的柔性肽重復序列（G4S）3連接，保證了2個蛋白之間的空間結構不受影響。共獲得了純度較高的3種蛋白，濃縮以后，3種蛋白的濃度統一確定為0.5 mg/mL。同時還獲得了效價很高的抗Gluc1C的兔血清，為將來嵌合體的活性研究提供了基礎。未來的研究還會涉及到嵌合體在畢赤酵母系統中表達是否會增強其活力；嵌合體在pH耐受、熱穩定性方面是否有提高。

參考文獻

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