miRNA生物合成相關基因的遺傳變異與胃癌患者生存的關系

廖瑜露 李 俊 萬以葉 彭麗香 廖瑜倩

全世界范圍內，胃癌是第5大最常見惡性腫瘤，死亡率在惡性腫瘤中居第三位[1]。早期胃癌可能通過根治性手術及輔助化療等治療手段達到治愈。兩項隨機、Ⅲ期臨床研究證實，在根治性手術的基礎上給予替吉奧[2]或奧沙利鉑聯合卡培他濱[3]方案輔助治療可進一步提高生存期。

miRNA生物合成的關鍵基因如DICER、RAN、XPO、EPO、GEMIN可能與黑色素瘤、卵巢癌和T細胞淋巴瘤等惡性腫瘤的發生、發展相關[4-6]。本研究在接受奧沙利鉑聯合氟尿嘧啶類藥物術后輔助化療的早期及局部晚期胃癌患者中分析DICER rs13078，DICER rs3742330，RAN rs14035，XPO5 rs2257082，XPO5 rs11077遺傳變異與患者無病生存期(DFS)和總生存期(OS)的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2011年1月至2012年12月在我院就診、病例資料較為完整、接受根治性手術，接受奧沙利鉑聯合氟尿嘧啶類藥物術后輔助化療的胃腺癌患者96例。根據AJCC分期(美國癌癥分期聯合委員會，2010年第7版)為Ⅰ～Ⅲ期[7]。排除接受姑息性手術、接受過術前化療或放療的患者。

1.2 治療方法

奧沙利鉑聯合氟尿嘧啶類藥物方案輔助化療[8-9]。具體方案：① 71例患者使用mFOLFOX6方案，奧沙利鉑85 mg/m2第1天+亞葉酸鈣400 mg/m2第1天+氟尿嘧啶400 mg/m2第1天，靜脈推注+氟尿嘧啶2 400 mg/m2持續泵入46 h，14天為1個周期，共12個周期。②12例患者使用奧沙利鉑130 mg/m2第1天+亞葉酸鈣300 mg第1～4天+替加氟1 g第1～4天，21天為1個周期×8個周期。③8例患者使用XELOX方案，奧沙利鉑130 mg/m2+卡培他濱1 000 mg/m2bid第1～14天口服，21天為1個周期×8個周期。④5例患者使用SOX方案，奧沙利鉑130 mg/m2+替吉奧40～60 mg bid 第1～14天口服，21天為1個周期×8個周期。

1.3 SNP檢測方法

化療前采集所有患者的外周血標本5 ml。采用傳統的酚-氯仿法提取基因組DNA。采用MassARRAY MALDI-TOF 系統進行基因分型[10]，由北京博淼生物公司進行。檢測位點：DICER rs13078、DICER rs3742330、RAN rs14035、XPO5 rs11077和XPO5 rs2257082。所有標本檢測兩次，并設立不含DNA的陰性對照。兩次檢測的一致率為100%[8]。見表1。

表1 PCR引物

1.4 研究終點和統計學方法

每3個月進行影像學檢查了解患者復發轉移情況。無病生存期(DFS，disease-free survival)指從手術確診開始至出現疾病復發或轉移的時間。總生存期(OS，overall survival)指從手術確診至因任何原因死亡或末次隨訪的時間。統計分析采用SPSS 18.0軟件。所有的統計檢驗均為雙側概率檢驗。采用Kaplan-Meier 法進行單因素生存分析，組間比較采用Log-rank檢驗，采用COX風險比例模型進行多因素預后分析。

2 結果

2.1 全組患者基本特征

全組患者中位年齡54歲(19～79歲)。年齡<60歲及≥60歲的患者分別為67例(69.8%)和29例(30.2%)。67例患者為男性(69.8%)。僅有8例患者病灶位于賁門部(8.3%)。高中分化腺癌26例(27.1%)，低分化腺癌及印戒細胞癌患者70例(72.9%)。絕大多數患者為T3-4(77例，80.2%)。多數患者存在淋巴結轉移(68例，70.8%)。Ⅲ期患者60例(62.5%)，見表2。

2.2 臨床病理特征與DFS和OS的關系

全組患者2年DFS為60.5%，3年OS為73.2%。分析臨床病理特征與DFS、OS的相關性。結果顯示，T1-2患者的2年DFS顯著高于T3-4患者，分別為88.2%和53.1%(P=0.014)。臨床分期與2年DFS顯著相關，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者2年DFS分別為100.0%、66.5%和50.4%(P=0.023)。

N分期(P=0.017)、臨床分期(P=0.020)與3年OS顯著相關。淋巴結轉移患者的3年OS顯著低于無淋巴結轉移患者，分別為63.7%和88.6%。見表2。

表2 臨床病理特征與患者生存的關系/%

2.3 基因型與DFS和OS的關系

分析DICER rs13078，DICER rs3742330，RAN rs14035，XPO5 rs11077，XPO5 rs2257082基因型與2年DFS及3年OS的關系，結果提示，XPO5 rs11077基因型與3年OS顯著相關，AC基因型患者的3年OS顯著低于AA基因型患者，見表3。

多因素預后分析顯示，淋巴結狀態(P=0.033，RR:5.033,95%CI:1.140～22.224)及XPO5 rs11077基因型(P=0.045，RR:0.307,95%CI:0.096～0.976)為3年OS的獨立預后因素。

表3 基因分型與生存的關系/%

3 討論

人類miRNA的生物合成分為兩個階段。首先，編碼miRNA的基因轉錄出初級miRNA(pri-miRNA)；pri-miRNA在細胞核中被RNaseIIIDROSHA切割成60～70個核苷酸的前體miRNA(pre-miRNA)。然后，pre-miRNA借助RAN-GTPase(RAN)依賴性Exportin-5(XPO5)從核內轉運至胞質，由RNaseIIIDICER進一步切割產生成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與其他蛋白質一起組成RNA誘導的基因沉默復合物(RISC，RNA-induced silencing complex)，從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制[11]。遺傳變異是影響基因表達或功能的重要作用機制，miRNA合成相關基因的遺傳變異可導致miRNA合成相關蛋白表達的異常，從整體水平影響miRNA的表達和功能，影響多種腫瘤的發生及預后[12]。

已有研究證實rs11077基因多態與我國小細胞肺癌[13]、非小細胞肺癌[14]及肝癌[15]等惡性腫瘤患者預后相關。Guo等[13]對42例小細胞肺癌患者檢測rs11077基因型，發現攜帶AA基因型患者的生存期明顯長于攜帶AC+CC基因型者(P=0.023)，rs11077基因型是獨立預后因素。Ding等[14]在接受鉑類藥物治療的112例非小細胞肺癌患者中分析了rs11077與患者療效及生存的關系，發現AC基因型患者化療療效優于AA基因型患者，AC基因型患者的生存期長于AA基因型患者。Liu等[15]在肝細胞癌患者中分析了miRNA生物合成相關基因多態與患者預后的關系，發現rs11077 AA基因型患者的生存差于AC及CC基因型患者。

XPO5 rs11077影響惡性腫瘤患者生存的機制還不明了。在結腸癌細胞株中[16]，XPO5突變及失活可導致miRNA生物合成減少及miRNA靶向抑制的降低，而復活XPO5則可恢復miRNA由細胞核至細胞質的轉運并起到抑制腫瘤的作用。rs11077多態位于XPO5基因的3’非編碼區(3’UTR)，可能影響XPO5的表達水平，進而影響腫瘤患者的生存期。由于在不同研究中，基因型與預后的關系有所不同，一些學者認為在不同類型的腫瘤細胞中，SNP對miRNA的調節作用可能有所不同[15]。

目前尚未見miRNA生物合成相關基因多態與胃癌預后的相關研究。我國學者[17]曾對XPO5 rs11077、RAN rs14035、DICER rs3742330、TNRC6B rs9623117、GEMIN3 rs197412以及GEMIN4 rs2740348與胃癌易感性的關系進行研究，發現攜帶RAN rs14035 CC基因型、DICER rs3742330 AA基因型、TNRC6B rs9623117 TT基因型者胃癌發生風險高。我們在接受奧沙利鉑及氟尿嘧啶類藥物輔助治療的胃癌患者中，對miRNA生物合成相關基因的SNP進行研究，發現XPO5 rs11077 基因型與胃癌患者預后相關，攜帶AC基因型的患者預后更差。本研究中無1例患者為CC基因型，與文獻報道的中國人群中CC基因型少于1%一致[13-15]。

本研究中，DICER rs13078、DICER rs3742330、RAN rs14035、XPO5 rs2257082基因型與胃癌患者生存均無明顯相關性。也有學者對這些基因多態與淋巴瘤[18]及肝細胞癌[19]患者生存的關系進行了研究，結果也不一致。DICER rs13078與肝癌患者生存無關，DICER rs3742330與肝癌及T細胞淋巴瘤生存相關，RAN rs14035與肝癌患者預后相關但與非霍奇金淋巴瘤生存無關。由于本研究及上述研究病例數均有限，還需擴大樣本量進行驗證。

綜上所述，本研究顯示XPO5 rs11077 基因型與接受奧沙利鉑及氟尿嘧啶類藥物輔助化療的非轉移性胃癌患者預后相關，是獨立的預后因素，攜帶AC基因型的患者預后更差。本研究納入的病例數及檢測位點有限，為了進一步驗證本研究的結果，更好的闡明miRNA生物合成相關SNP在胃癌發生、發展中的作用，還需要擴大樣本量，增加檢測位點，進行更為深入的機制研究。

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