不同標本保存條件對人類免疫缺陷病毒核酸鑒別試驗的影響

孫 婧 黃力勤 劉正敏 王 瑞

核酸檢測(nucleic acid amplification testing，NAT)因其對病毒檢測的高度特異性和靈敏度，目前已成為采供血機構血液篩查中最為有效的檢測技術，并得到了廣泛的推廣和應用。根據國家衛生計生委頒布的“血站技術操作規程(2015版)”[1]中對核酸檢測的規定，進行核酸檢測的標本應在72 h內進行檢測。然而，由于Ultrio Plus核酸檢測試劑的特殊性，分為人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)聯合檢測和鑒別檢測，血站實驗室一般可在72 h內完成聯合檢測并發放報告，但對于鑒別檢測，各血站進行檢測的時限不盡相同，有時會因為一些特殊原因需要將標本保存較長時間才能進行核酸鑒別檢測。然而，目前尚未對于核酸鑒別檢測前標本保存條件的研究，尤其缺乏低病毒載量標本的保存條件的研究，因此，本研究選取3倍檢測限(limit of detection，LOD)和0.5倍LOD兩種濃度的HIV-1弱陽性標本，通過評估不同保存溫度和保存時間下鑒別檢測的陽性率，來確定核酸鑒別檢測前合理的標本保存條件。

1 材料和方法

1.1 檢測試劑

Ultrio Plus HIV-1鑒別檢測試劑(美國Grifols公司，批號：156796，有效期：2018.02.15)。

1.2 標本來源

采用60 IU/ml(3倍LOD)和5 IU/ml(0.5倍LOD)的兩組HIV-1陽性樣本各6支，每支3 ml。樣本為世界衛生組織(World Health Organization，WHO)10/152標準品稀釋(北京康徹斯坦公司)。

1.3 實驗儀器

TIGRIS核酸檢測系統(美國Grifols公司)。

1.4 實驗方法

按照常規血液檢測流程對60 IU/ml和5 IU/ml的HIV-1 WHO標本進行核酸HIV-1 RNA鑒別檢測，每支樣品檢測5次，每種濃度的樣品共檢測30次，計算兩組標本的HIV-1陽性檢出率。再將兩組標本分別放置在在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃冰箱內，分別在保存1 d、3 d和7 d時取出，進行與上述方法相同的30次核酸檢測，并計算HIV-1陽性檢出率，以0 d保存標本的陽性檢出率作為對照。

1.5 統計學方法

利用SPSS 19.0統計軟件對標本保存溫度和時間對HIV-1鑒別檢測陽性檢出率的影響進行x2檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 保存條件對3倍LOD HIV陽性標本鑒別檢出率的影響

結果顯示，3倍LOD HIV陽性標本即在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃條件下保存7 d，可以100%檢出。

2.2 保存條件對0.5倍LOD HIV陽性標本鑒別檢出率的影響

(1)0.5倍LOD HIV-1陽性標本在3種不同溫度下保存1 d后，陽性檢出率基本保持不變；保存3 d后，4 ℃和-20 ℃條件下的標本陽性檢出率已明顯開始下降，下降程度達5%以上，甚至4 ℃條件的標本檢出率已降至50%以下，而此時-80 ℃條件的標本陽性檢出率仍未出現明顯改變；到了第7 d，只有-80 ℃條件下的標本陽性檢出率仍維持在50%以上，而其余兩種溫度條件下標本陽性檢出率已降至50%以下。

(2)在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃下保存0.5倍LOD HIV-1陽性標本7 d，3種溫度條件下標本的陽性檢出率均明顯下降，僅-80 ℃條件下陽性檢出率與0 d對照一致，仍為56.67%，并且以4 ℃條件下標本陽性檢出率下降最為顯著，該保存溫度保存7 d相對于0 d對檢出率的影響差異有統計學意義(x2=4.34，P＜0.05)；而-20 ℃和-80 ℃兩個溫度下標本檢出率雖有不同程度的下降，但差異無統計學意義(x2=1.67，x2=0.00；P＞0.05)，見表1。

表1 5 IU/ml(0.5倍LOD)HIV陽性標本在不同保存溫度和時間下檢出率[%(次)]

3 討論

血液核酸檢測是直接對病原體核酸進行提取、擴增和檢測等一系列檢測技術的總稱，具有對病原體檢測靈敏度和特異性高，且能有效縮短病毒感染后檢測“窗口期”等特點[2-4]。根據國家標準“全血及成分血質量要求”[5]的規定，對臨床用血進行HBV、HCV和HIV等病原體的篩查檢測時，除常規的免疫學檢測外還需進行病毒的核酸檢測。由于血液在離開人體后，血液內的病毒核酸物質經過長時間放置之后會逐漸降解，當病毒載量降至核酸檢測試劑的最低LOD甚至更低時，有可能會被漏檢[6-8]。因此“血站技術操作規程(2015版)”[1]規定，核酸檢測應在72 h內進行。但是在實際的血液篩查工作中，應用Ultrio Plus試劑的實驗室，需在72 h內完成核酸聯檢后，還需進行鑒別檢測才能最終判定標本所攜帶的病原體類型。而對于鑒別檢測前的保存條件卻無統一的認識，血站根據其試劑使用和聯檢陽性率選擇進行鑒別檢測間隔時間。此外，雖然核酸聯檢陽性標本將進行報廢處理，但最終的鑒別檢測結果將影響后續對獻血者的追蹤工作。目前，對核酸標本檢測前保存條件的研究報道僅限于對聯檢檢測前的研究，尚無對鑒別檢測前保存條件的研究和報道[9-11]。

本研究以HIV RNA為代表研究標本保存條件對鑒別檢測的影響，其原因為：①HIV RNA相對HCV RNA和HBV DNA穩定性差，易受環境因素的影響，具有代表性[10]；②因目前只有HIV感染的獻血者由疾病控制部門進行追蹤，這依賴于鑒別檢測結果，具有現實意義。此外，本研究重點分析了鑒別前保存條件對低病毒載量HIV RNA的影響，而對高載量HIV病毒已有相關研究[9，12]。

本研究中，首先分析了環境因素對3倍LOD的低載量HIV病毒標本的影響，60 IU/ml(3 LOD)的標本進行核酸檢測，在3種溫度條件下放置7 d后仍然能100%被檢出，表明這3種保存溫度保存7 d并無明顯影響標本的病毒載量，這與文獻中的實驗結果一致[7，12]。同時，本研究將極低濃度(5 IU/ml，0.5 LOD)HIV-1標本同樣在3種不同的溫度下放置了7 d，核酸檢測的結果與3倍LOD的標本截然不同。Procleix Utrio Plus試劑說明書標示的50%檢出限所需的病毒濃度為4.7 IU/ml(95%置信區間4.0～5.7 IU/ml)，因此，理論上5 IU/ml濃度的血清標本，核酸檢測的陽性檢出率應該在50%左右。檢測結果顯示，在初始條件下，所有標本的陽性檢出率均在50%以上，與Procleix Utrio Plus Assay產品說明及文獻報道的實驗結果較為一致[13]。在經過1 d的保存之后，所有標本的陽性檢出率均未出現明顯的下降。保存了3 d之后，3組檢測結果出現了一些差異，4 ℃條件下保存的標本陽性檢出率已略＜50%，而其余兩個溫度下檢出率均在50%以上，并且4 ℃和-20 ℃條件下標本陽性檢出率的下降幅度已＞5%，4 ℃內的標本檢出率已降至50%以下，而-20 ℃內的標本仍能維持50%的檢出率，表明病毒載量極低的標本在-20 ℃以下的條件下保存3 d再進行鑒別檢測，并不會明顯影響檢出效率，但保存在4 ℃條件下則可能會導致漏檢率的升高。然而，保存7 d之后，僅-80 ℃條件下保存的標本陽性檢出率仍能保持在50%以上，其他兩組標本均未達到50%的檢出率，并且4 ℃條件下將鑒別標本保存7 d對其陽性檢出率的影響具有統計學意義，表明保存在該溫度下會造成陽性檢出率明顯地下降。而-20 ℃條件下標本陽性檢出率也已經下降到50%以下，下降幅度＞15%，因此-20 ℃的條件也并不適合將鑒別檢測的標本保存7 d。實驗結果表明，鑒別檢測標本若需要保存7 d，則保存于-80 ℃的條件下更為合適。

根據本次檢測主要考慮鑒別檢測前保存的時間和溫度條件是影響其陽性檢出率的主要因素，而這兩種因素影響檢出率的原因可能主要是因為在較高溫度和長時間的保存中，極低濃度的HIV病毒核酸穩定性較差，更容易降解，造成濃度進一步降低以致于應用常規的核酸檢測試劑和系統檢測富集不到足夠拷貝數的病毒核酸，則檢測系統將其判定為非反應性。因此，盡管核酸檢測能比酶免方法在病毒感染后更短的時間內檢測到病毒核酸，但是對低病毒載量的標本仍有漏檢的風險，可能酶免檢測與核酸檢測相結合的方式更有利于保障血液的安全[12-15]。影響鑒別檢測結果的除標本的保存溫度和時間外，可能還有保存的試管、標本離心的時間和轉速等其他許多因素，尚需要進一步研究和探討。

采用60 IU/ml的HIV-1標本保存7 d，鑒別檢測的陽性檢出率均為100%，表明3倍LOD以上濃度的HIV-1標本無論在何種溫度放置7 d均可完全被檢出。但是5 IU/ml的低濃度HIV-1標本，在4 ℃和-20 ℃放置7 d會嚴重影響鑒別檢測的檢出率，而-80 ℃的溫度條件下將鑒別標本放置7 d后陽性檢出率并未明顯下降，表明-80 ℃的條件更有利于低濃度的鑒別檢測標本進行長時間保存，使陽性標本能有效地被檢出，從而更有效地保障血液安全。

參考文獻

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